發(fā)布時(shí)間：2017-04-11 11:11

  本文關(guān)鍵詞：多種核酸擴(kuò)增技術(shù)研究及其在線粒體DNA檢測中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人類線粒體基因組DNA分子為一個(gè)16569bp的雙鏈環(huán)狀DNA分子,該基因組與核基因組相互獨(dú)立又互相依存,線粒體有13個(gè)編碼基因,22個(gè)tRNA和2個(gè)rRNA,許多疾病都與線粒體基因組相關(guān)。線粒體又有獨(dú)特的母系遺傳特性,是研究生物起源和進(jìn)化的重要材料。K562細(xì)胞是人類慢性髓系白血病細(xì)胞,該細(xì)胞容易獲取,具有各種分化特性,是實(shí)驗(yàn)室研究的重要材料。隨著人類基因組計(jì)劃的完成,各種測序手段相繼出現(xiàn),人們在獲取遺傳序列信息方面更加方便,利用測序手段研究線粒體基因組,對其進(jìn)行正確的拼接和后續(xù)的功能注釋在診斷線粒體疾病,保護(hù)生物學(xué)和群體遺傳學(xué),以及確定線粒體在進(jìn)化上的地位都有重要作用意義。本論文以K562細(xì)胞線粒體基因組為研究對象,通過實(shí)驗(yàn)的方法設(shè)計(jì)了一組對比實(shí)驗(yàn),分別用基于PCR的方法和基于多重置換擴(kuò)增的全基因組等溫?cái)U(kuò)增來獲得線粒體基因組,然后利用一代Sanger測序方法和二代Illumina測序方法對我們獲取的線粒體基因組進(jìn)行測序,最終獲得了K562細(xì)胞線粒體基因組序列信息。1、我們利用基于PCR的擴(kuò)增方法,通過文獻(xiàn)綜述和預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定了45對線粒體擴(kuò)增引物,對線粒體環(huán)狀DNA分子的全長進(jìn)行無縫擴(kuò)增,每一個(gè)擴(kuò)增片段長度不超過1000bp,每一個(gè)擴(kuò)增片段的上下游都有一段的overlap。然后對這些擴(kuò)增片段利用ABI的3730測序儀進(jìn)行測序,獲取每一個(gè)擴(kuò)增片段的序列信息。對于一代測序下機(jī)數(shù)據(jù),我們使用NCBI數(shù)據(jù)庫的blast在線比對工具將我們的每一個(gè)擴(kuò)增fragment與人類線粒體標(biāo)準(zhǔn)參考基因組(NC_012920.1)進(jìn)行比對,然后手動(dòng)對這些比對后的片段進(jìn)行手動(dòng)拼接,最終獲得了K562細(xì)胞線粒體的完整基因組。2、我們利用基于多重置換擴(kuò)增的線粒體基因組等溫?cái)U(kuò)增方法對我們的K562細(xì)胞線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增。我們使用QIAGEN公司的REPLI-g Mitochondrial DNA kit對我們的K562核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增,一般地線粒體DNA在提取過程中往往與核DNA很難分開,所以我們選擇對K562全基因組中線粒體DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)過程中我們對樣本進(jìn)行了不同程度的稀釋,發(fā)現(xiàn)將樣本稀釋到0.1個(gè)核DNA的單倍量級時(shí)(即3.3pg/uL),再進(jìn)行線粒體基因組擴(kuò)增后10組平行樣本中只有3個(gè)樣本擴(kuò)增出。根據(jù)我們的全基因組稀釋樣本的測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在0.1個(gè)gDNA單倍量級時(shí),線粒體DNA與gDNA的reads覆蓋度之比在4-16倍之間,這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較類似,說明該線粒體基因組擴(kuò)增試劑盒滿足我們實(shí)驗(yàn)的要求。利用該試劑盒得到的線粒體基因組進(jìn)行了二代Illumina測序。3、一代測序數(shù)據(jù)在比對過程中,我們發(fā)現(xiàn)了39個(gè)單堿基突變位點(diǎn)和一個(gè)短片段缺失,這些突變位點(diǎn)分布在線粒體基因組的全長,包括rRNA、tRNA、D-Loop以及基因編碼區(qū)。我們將這些突變位點(diǎn)分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分,對于編碼區(qū)的突變位點(diǎn)分為錯(cuò)義突變和無義突變分別討論相關(guān)的功能意義。我們利用的是NCBI基因數(shù)據(jù)庫、MITOMAP線粒體基因數(shù)據(jù)庫以及UniprotKB蛋白數(shù)據(jù)庫對我們的突變位點(diǎn)進(jìn)行查找,我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變位點(diǎn)都已經(jīng)存在于這些數(shù)據(jù)庫之中,我們根據(jù)查找到的信息對每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了功能注釋,分析總結(jié)了各位點(diǎn)的生物學(xué)意義。對于少量數(shù)據(jù)庫中查找不到的位點(diǎn),我們利用Jpred蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測在線分析軟件分析了這些位點(diǎn)改變造成的氨基酸改變進(jìn)而可能對整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成的影響,并且分析了這種影響可能引起的功能變化。對于兩種不同方法獲得的線粒體基因組我們利用了二代Illumina測序方法進(jìn)行了測序,并對兩種方法得到的測序結(jié)果進(jìn)行了初步的比較,并且對一代測序數(shù)據(jù)分析時(shí)得到的幾個(gè)具有異議性的位點(diǎn)進(jìn)行了二代測序方法的進(jìn)一步分析。
【關(guān)鍵詞】：線粒體基因組 PCR 全基因組擴(kuò)增 Sanger測序 Illumina測序 單堿基突變 注釋
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-23
• 1.1 引言11-12
• 1.2 線粒體基因組擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展12-17
• 1.2.1 基于PCR的線粒體基因組擴(kuò)增技術(shù)12-16
• 1.2.1.1 PCR技術(shù)的起源和原理13
• 1.2.1.2 The-long PCR of線粒體DNA13-14
• 1.2.1.3 多引物線粒體基因組PCR擴(kuò)增14-16
• 1.2.2 基于多重置換擴(kuò)增技術(shù)(MDA)的線粒體基因組擴(kuò)增方法16-17
• 1.3 核酸測序技術(shù)的發(fā)展17-20
• 1.3.1 第一代Sanger測序技術(shù)17-18
• 1.3.2 第二代測序技術(shù)18-19
• 1.3.2.1 Roche公司的454測序技術(shù)18
• 1.3.2.2 Illumina公司的Solexa測序18-19
• 1.3.2.3 ABI公司的SOLiD測序技術(shù)19
• 1.3.3 第三代測序技術(shù)19-20
• 1.4 K562細(xì)胞系研究20-21
• 1.5 論文的主要研究內(nèi)容21-23
• 第二章 K562細(xì)胞的培養(yǎng)23-29
• 2.1 引言23
• 2.2 線粒體DNA檢測研究的材料K562細(xì)胞的培養(yǎng)23-27
• 2.2.1 K562細(xì)胞培養(yǎng)的材料與方法23-24
• 2.2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株23
• 2.2.1.2 主要儀器23
• 2.2.1.3 主要試劑23-24
• 2.2.1.4 主要試劑的配制24
• 2.2.2 K562細(xì)胞培養(yǎng)24-27
• 2.2.2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)24-25
• 2.2.2.2 K562細(xì)胞的收集25
• 2.2.2.3 K562細(xì)胞的傳代培養(yǎng)25-26
• 2.2.2.4 K562細(xì)胞的凍存26
• 2.2.2.5 K562細(xì)胞的復(fù)蘇26-27
• 2.3 本章小結(jié)27-29
• 第三章 利用多種核酸擴(kuò)增技術(shù)獲得線粒體基因組29-57
• 3.1 引言29
• 3.2 基于PCR的K562細(xì)胞線粒體基因組的獲取29-47
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料30-34
• 3.2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備30
• 3.2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材30-31
• 3.2.1.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配制31
• 3.2.1.4 基于PCR擴(kuò)增方法獲取線粒體基因組所用的引物31-34
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法34-38
• 3.2.2.1 K562細(xì)胞系全基因組DNA提取35-36
• 3.2.2.2 對提取的K562細(xì)胞全基因組進(jìn)行定量36-37
• 3.2.2.3 對提取的K562細(xì)胞全基因組進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測37-38
• 3.2.2.4 對定量后的K562細(xì)胞全基因組進(jìn)行線粒體基因組擴(kuò)增38
• 3.2.2.5 擴(kuò)增后的線粒體DNA分子產(chǎn)物片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測38
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析38-44
• 3.2.3.1 K562細(xì)胞全基因組DNA提取瓊脂糖凝膠電泳定性結(jié)果38-39
• 3.2.3.2 K562細(xì)胞全基因組DNA提取的定量結(jié)果39-40
• 3.2.3.3 45對線粒體引物擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜結(jié)果40-44
• 3.2.4 K562細(xì)胞線粒體基因組DNA分子擴(kuò)增產(chǎn)物測序與拼接44-47
• 3.2.4.1 K562細(xì)胞線粒體基因組DNA分子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行一代測序44-45
• 3.2.4.2 測序結(jié)果進(jìn)行序列比對45-46
• 3.2.4.3 序列比對結(jié)果進(jìn)行拼接46-47
• 3.3 基于多重置換擴(kuò)增技術(shù)的K562細(xì)胞線粒體基因組等溫?cái)U(kuò)增47-54
• 3.3.1 K562細(xì)胞線粒體基因組等溫?cái)U(kuò)增47-49
• 3.3.1.1 全基因組等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)方法47-48
• 3.3.1.2 瓊脂糖凝膠電泳定性檢測和Qubit 2.0定量檢測48
• 3.3.1.3 對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行線粒體DNA普通PCR檢測48-49
• 3.3.1.4 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測49
• 3.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-51
• 3.3.2.1 線粒體基因組等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳49-50
• 3.3.2.2 線粒體基因組擴(kuò)增產(chǎn)物的Qubit定量50-51
• 3.3.2.3 線粒體基因組擴(kuò)增后普通PCR(線粒體DNA引物)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜51
• 3.3.3 基于稀釋樣本的REPLI-mt kit驗(yàn)證51-54
• 3.3.3.1 實(shí)驗(yàn)方法51-52
• 3.3.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-54
• 3.3.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析54
• 3.3.4 對K562細(xì)胞線粒體基因組樣本進(jìn)行二代測序54
• 3.4 本章小結(jié)54-57
• 第四章 K562細(xì)胞線粒體基因組測序結(jié)果分析57-69
• 4.1 引言57
• 4.2 一代測序數(shù)據(jù)的比對、拼接57-62
• 4.2.1 K562細(xì)胞線粒體基因組一代測序數(shù)據(jù)比對分析57-59
• 4.2.2 K562細(xì)胞線粒體基因組一代測序數(shù)據(jù)拼接59-62
• 4.3 一代測序數(shù)據(jù)SNP位點(diǎn)分析62-66
• 4.3.1 編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)62-65
• 4.3.1.1 錯(cuò)義突變63-65
• 4.3.1.2 同義突變65
• 4.3.2 非編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)65-66
• 4.4 Illumina二代測序數(shù)據(jù)分析66-68
• 4.4.1 兩種不同方法獲得的線粒體基因組進(jìn)行二代測序后比對情況分析66-67
• 4.4.2 利用二代測序數(shù)據(jù)對一代測序數(shù)據(jù)中異議的單堿基位點(diǎn)進(jìn)行分析67-68
• 4.5 本章小結(jié)68-69
• 第五章 總結(jié)與展望69-71
• 5.1 研究總結(jié)69
• 5.2 工作展望69-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 致謝77-78
• 附錄78-86
• 攻讀碩士學(xué)位期間科研成果86

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本文編號：298967