本文關鍵詞：多種核酸擴增技術研究及其在線粒體DNA檢測中的應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人類線粒體基因組DNA分子為一個16569bp的雙鏈環(huán)狀DNA分子,該基因組與核基因組相互獨立又互相依存,線粒體有13個編碼基因,22個tRNA和2個rRNA,許多疾病都與線粒體基因組相關。線粒體又有獨特的母系遺傳特性,是研究生物起源和進化的重要材料。K562細胞是人類慢性髓系白血病細胞,該細胞容易獲取,具有各種分化特性,是實驗室研究的重要材料。隨著人類基因組計劃的完成,各種測序手段相繼出現(xiàn),人們在獲取遺傳序列信息方面更加方便,利用測序手段研究線粒體基因組,對其進行正確的拼接和后續(xù)的功能注釋在診斷線粒體疾病,保護生物學和群體遺傳學,以及確定線粒體在進化上的地位都有重要作用意義。本論文以K562細胞線粒體基因組為研究對象,通過實驗的方法設計了一組對比實驗,分別用基于PCR的方法和基于多重置換擴增的全基因組等溫擴增來獲得線粒體基因組,然后利用一代Sanger測序方法和二代Illumina測序方法對我們獲取的線粒體基因組進行測序,最終獲得了K562細胞線粒體基因組序列信息。1、我們利用基于PCR的擴增方法,通過文獻綜述和預實驗最終確定了45對線粒體擴增引物,對線粒體環(huán)狀DNA分子的全長進行無縫擴增,每一個擴增片段長度不超過1000bp,每一個擴增片段的上下游都有一段的overlap。然后對這些擴增片段利用ABI的3730測序儀進行測序,獲取每一個擴增片段的序列信息。對于一代測序下機數(shù)據(jù),我們使用NCBI數(shù)據(jù)庫的blast在線比對工具將我們的每一個擴增fragment與人類線粒體標準參考基因組(NC_012920.1)進行比對,然后手動對這些比對后的片段進行手動拼接,最終獲得了K562細胞線粒體的完整基因組。2、我們利用基于多重置換擴增的線粒體基因組等溫擴增方法對我們的K562細胞線粒體基因組進行擴增。我們使用QIAGEN公司的REPLI-g Mitochondrial DNA kit對我們的K562核酸樣本進行擴增,一般地線粒體DNA在提取過程中往往與核DNA很難分開,所以我們選擇對K562全基因組中線粒體DNA進行特異性擴增。實驗過程中我們對樣本進行了不同程度的稀釋,發(fā)現(xiàn)將樣本稀釋到0.1個核DNA的單倍量級時(即3.3pg/uL),再進行線粒體基因組擴增后10組平行樣本中只有3個樣本擴增出。根據(jù)我們的全基因組稀釋樣本的測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在0.1個gDNA單倍量級時,線粒體DNA與gDNA的reads覆蓋度之比在4-16倍之間,這與我們的實驗結果比較類似,說明該線粒體基因組擴增試劑盒滿足我們實驗的要求。利用該試劑盒得到的線粒體基因組進行了二代Illumina測序。3、一代測序數(shù)據(jù)在比對過程中,我們發(fā)現(xiàn)了39個單堿基突變位點和一個短片段缺失,這些突變位點分布在線粒體基因組的全長,包括rRNA、tRNA、D-Loop以及基因編碼區(qū)。我們將這些突變位點分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分,對于編碼區(qū)的突變位點分為錯義突變和無義突變分別討論相關的功能意義。我們利用的是NCBI基因數(shù)據(jù)庫、MITOMAP線粒體基因數(shù)據(jù)庫以及UniprotKB蛋白數(shù)據(jù)庫對我們的突變位點進行查找,我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變位點都已經(jīng)存在于這些數(shù)據(jù)庫之中,我們根據(jù)查找到的信息對每個位點進行了功能注釋,分析總結了各位點的生物學意義。對于少量數(shù)據(jù)庫中查找不到的位點,我們利用Jpred蛋白質結構預測在線分析軟件分析了這些位點改變造成的氨基酸改變進而可能對整個蛋白質結構造成的影響,并且分析了這種影響可能引起的功能變化。對于兩種不同方法獲得的線粒體基因組我們利用了二代Illumina測序方法進行了測序,并對兩種方法得到的測序結果進行了初步的比較,并且對一代測序數(shù)據(jù)分析時得到的幾個具有異議性的位點進行了二代測序方法的進一步分析。
【關鍵詞】：線粒體基因組 PCR 全基因組擴增 Sanger測序 Illumina測序 單堿基突變 注釋
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R440
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-23
• 1.1 引言11-12
• 1.2 線粒體基因組擴增技術的發(fā)展12-17
• 1.2.1 基于PCR的線粒體基因組擴增技術12-16
• 1.2.1.1 PCR技術的起源和原理13
• 1.2.1.2 The-long PCR of線粒體DNA13-14
• 1.2.1.3 多引物線粒體基因組PCR擴增14-16
• 1.2.2 基于多重置換擴增技術(MDA)的線粒體基因組擴增方法16-17
• 1.3 核酸測序技術的發(fā)展17-20
• 1.3.1 第一代Sanger測序技術17-18
• 1.3.2 第二代測序技術18-19
• 1.3.2.1 Roche公司的454測序技術18
• 1.3.2.2 Illumina公司的Solexa測序18-19
• 1.3.2.3 ABI公司的SOLiD測序技術19
• 1.3.3 第三代測序技術19-20
• 1.4 K562細胞系研究20-21
• 1.5 論文的主要研究內容21-23
• 第二章 K562細胞的培養(yǎng)23-29
• 2.1 引言23
• 2.2 線粒體DNA檢測研究的材料K562細胞的培養(yǎng)23-27
• 2.2.1 K562細胞培養(yǎng)的材料與方法23-24
• 2.2.1.1 實驗細胞株23
• 2.2.1.2 主要儀器23
• 2.2.1.3 主要試劑23-24
• 2.2.1.4 主要試劑的配制24
• 2.2.2 K562細胞培養(yǎng)24-27
• 2.2.2.1 細胞計數(shù)24-25
• 2.2.2.2 K562細胞的收集25
• 2.2.2.3 K562細胞的傳代培養(yǎng)25-26
• 2.2.2.4 K562細胞的凍存26
• 2.2.2.5 K562細胞的復蘇26-27
• 2.3 本章小結27-29
• 第三章 利用多種核酸擴增技術獲得線粒體基因組29-57
• 3.1 引言29
• 3.2 基于PCR的K562細胞線粒體基因組的獲取29-47
• 3.2.1 實驗材料30-34
• 3.2.1.1 實驗儀器設備30
• 3.2.1.2 實驗試劑及耗材30-31
• 3.2.1.3 實驗相關試劑配制31
• 3.2.1.4 基于PCR擴增方法獲取線粒體基因組所用的引物31-34
• 3.2.2 實驗方法34-38
• 3.2.2.1 K562細胞系全基因組DNA提取35-36
• 3.2.2.2 對提取的K562細胞全基因組進行定量36-37
• 3.2.2.3 對提取的K562細胞全基因組進行瓊脂糖凝膠電泳檢測37-38
• 3.2.2.4 對定量后的K562細胞全基因組進行線粒體基因組擴增38
• 3.2.2.5 擴增后的線粒體DNA分子產(chǎn)物片段進行瓊脂糖凝膠電泳檢測38
• 3.2.3 實驗結果與分析38-44
• 3.2.3.1 K562細胞全基因組DNA提取瓊脂糖凝膠電泳定性結果38-39
• 3.2.3.2 K562細胞全基因組DNA提取的定量結果39-40
• 3.2.3.3 45對線粒體引物擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜結果40-44
• 3.2.4 K562細胞線粒體基因組DNA分子擴增產(chǎn)物測序與拼接44-47
• 3.2.4.1 K562細胞線粒體基因組DNA分子PCR擴增產(chǎn)物進行一代測序44-45
• 3.2.4.2 測序結果進行序列比對45-46
• 3.2.4.3 序列比對結果進行拼接46-47
• 3.3 基于多重置換擴增技術的K562細胞線粒體基因組等溫擴增47-54
• 3.3.1 K562細胞線粒體基因組等溫擴增47-49
• 3.3.1.1 全基因組等溫擴增試驗方法47-48
• 3.3.1.2 瓊脂糖凝膠電泳定性檢測和Qubit 2.0定量檢測48
• 3.3.1.3 對擴增后的產(chǎn)物進行線粒體DNA普通PCR檢測48-49
• 3.3.1.4 對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測49
• 3.3.2 實驗結果49-51
• 3.3.2.1 線粒體基因組等溫擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳49-50
• 3.3.2.2 線粒體基因組擴增產(chǎn)物的Qubit定量50-51
• 3.3.2.3 線粒體基因組擴增后普通PCR(線粒體DNA引物)擴增產(chǎn)物電泳圖譜51
• 3.3.3 基于稀釋樣本的REPLI-mt kit驗證51-54
• 3.3.3.1 實驗方法51-52
• 3.3.3.2 實驗結果52-54
• 3.3.3.3 實驗結果分析54
• 3.3.4 對K562細胞線粒體基因組樣本進行二代測序54
• 3.4 本章小結54-57
• 第四章 K562細胞線粒體基因組測序結果分析57-69
• 4.1 引言57
• 4.2 一代測序數(shù)據(jù)的比對、拼接57-62
• 4.2.1 K562細胞線粒體基因組一代測序數(shù)據(jù)比對分析57-59
• 4.2.2 K562細胞線粒體基因組一代測序數(shù)據(jù)拼接59-62
• 4.3 一代測序數(shù)據(jù)SNP位點分析62-66
• 4.3.1 編碼區(qū)的SNP位點62-65
• 4.3.1.1 錯義突變63-65
• 4.3.1.2 同義突變65
• 4.3.2 非編碼區(qū)的SNP位點65-66
• 4.4 Illumina二代測序數(shù)據(jù)分析66-68
• 4.4.1 兩種不同方法獲得的線粒體基因組進行二代測序后比對情況分析66-67
• 4.4.2 利用二代測序數(shù)據(jù)對一代測序數(shù)據(jù)中異議的單堿基位點進行分析67-68
• 4.5 本章小結68-69
• 第五章 總結與展望69-71
• 5.1 研究總結69
• 5.2 工作展望69-71
• 參考文獻71-77
• 致謝77-78
• 附錄78-86
• 攻讀碩士學位期間科研成果86

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李明偉,鄒豐才,林瑞慶,朱興全;寄生性線蟲線粒體基因組研究進展[J];寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報;2005年01期

2 劉祚昌,趙世民,詹慶才,陳一吾;水稻線粒體基因組翻譯產(chǎn)物與細胞質雄性不育性[J];遺傳學報;1989年01期

3 高翼之;王世浚;;人線粒體基因組的序列與結構[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);1982年02期

4 Clarks A;鄭立紅;;線粒體基因組:缺失、疾病及進化[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;1992年01期

5 江莉;完整線粒體基因組鑒定細粒棘球絳蟲犬、馬株和犬、羊株的差別[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);2005年01期

6 李耀東;邵嘉會;;線粒體基因組全序列研究與動物分子系統(tǒng)發(fā)生的關系[J];青海醫(yī)學院學報;2006年01期

7 譚圍;王中鐸;郭昱嵩;劉楚吾;劉筠;;孟加拉笛鯛線粒體基因組序列結構及其進化[J];中國生物化學與分子生物學報;2009年03期

8 陳念;高慎淦;賴小平;劉鵬;王新;王羚酈;;藥用尖吻蝮蛇原動物的線粒體基因組全序列分析[J];中藥材;2013年05期

9 熊偉;張海洋;楊紅娟;杜亞曼;;哺乳動物細胞線粒體基因組的轉錄及調控機制研究進展[J];大理學院學報;2014年08期

10 彭巧玲,蒲友光,王志方,聶劉旺;中華鱉線粒體基因組序列分析[J];中國生物化學與分子生物學報;2005年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李博;劉剛;周立志;;禿鷲的線粒體基因組全序列研究[A];第十二屆全國鳥類學術研討會暨第十屆海峽兩岸鳥類學術研討會論文摘要集[C];2013年

2 朱興全;李明偉;林瑞慶;趙光輝;張媛;劉國華;艾琳;蘇昂;李淳;袁子國;;寄生蟲線粒體基因組學的研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜寄生蟲學分會第六次代表大會暨第十次學術研討會論文集[C];2009年

3 涂四利;方偉武;蔡旭;;線粒體基因組中最長保守序列的分析及其意義[A];中國運籌學會第七屆學術交流會論文集（中卷）[C];2004年

4 陳貴英;江建平;謝鋒;劉炯宇;鄭中華;;兩棲動物線粒體基因組結構特征分析[A];中國細胞生物學學會第九次會員代表大會暨青年學術大會論文摘要集[C];2007年

5 鐘金城;吳璽;;哺乳動物線粒體基因組的聚類分析及其系統(tǒng)進化研究[A];中國遺傳學會第八次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

6 吳相云;李小玲;徐曉東;喻子牛;;14種牡蠣線粒體基因組演化模式與系統(tǒng)發(fā)育分析[A];中國動物學會·中國海洋湖沼學會貝類學分會第九次會員代表大會暨第十五次學術討論會會議摘要集[C];2011年

7 馬俊業(yè);夏旭華;楊群;;普通海綿動物線粒體基因組:表型特征與譜系年代分析[A];全國微體古生物學分會第九屆會員代表大會暨第十四次學術年會、全國化石藻類專業(yè)委員會第七屆會員代表大會暨第十五次學術討論會論文摘要集[C];2012年

8 戚豫;張英;;臨床病例中線粒體基因組常見突變的篩查[A];遺傳學進步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

9 李明偉;林瑞慶;宋慧群;吳湘云;朱興全;;三種嚴重影響人和動物健康的弓首蛔蟲線粒體基因組的研究[A];第二屆全國人畜共患病學術研討會論文集[C];2008年

10 張棋麟;袁明龍;;青海草原毛蟲全線粒體基因組序列測定與分析[A];“創(chuàng)新驅動與現(xiàn)代植保”——中國植物保護學會第十一次全國會員代表大會暨2013年學術年會論文集[C];2013年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 記者 馬波;線粒體基因組的選擇壓力與動物運動能力相關[N];科技日報;2009年

2 本報記者 伍平;昆明動物所:線粒體基因組的選擇壓力決定動物運動能力[N];云南科技報;2009年

3 麻建麗;像體檢一樣檢測基因[N];溫州日報;2008年

4 記者 施艷燕;治病像換輪胎一樣簡單[N];蘇州日報;2011年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 宋勝楠;小腹繭蜂亞科（膜翅目：繭蜂科）比較線粒體基因組學與系統(tǒng)發(fā)育研究[D];浙江大學;2015年

2 石雅麗;陸地棉細胞質雄性不育系P30A與保持系P30B線粒體基因組測序與序列比較分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

3 趙林林;兩種海洋魚類的遺傳多樣性及基于線粒體基因組的石首魚科系統(tǒng)發(fā)育研究[D];中國海洋大學;2015年

4 周志軍;五種螽囍線粒體基因組的測定與直翅目譜系基因組學分析[D];陜西師范大學;2008年

5 申欣;軟甲綱動物和星蟲動物線粒體基因組特征及分子進化研究[D];中國科學院研究生院（海洋研究所）;2008年

6 陳磊;狼腸道菌群生態(tài)及犬科線粒體基因組比較和系統(tǒng)發(fā)育[D];東北林業(yè)大學;2010年

7 楊勁樹;海底熱液口甲殼類線粒體基因組及羅氏沼蝦生物鐘基因的分子解析與進化分析[D];浙江大學;2008年

8 張娟;單殖吸蟲線粒體基因組進化生物學研究[D];中山大學;2011年

9 曾慧花;四種蝗蟲線粒體基因組測序及系統(tǒng)發(fā)生分析[D];陜西師范大學;2013年

10 盧慧甍;霍山蹦蝗和意大利蝗全線粒體基因組的測序及分析[D];陜西師范大學;2006年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 胡曉笛;黑猩猩和大猩猩的比較線粒體基因組學研究[D];昆明理工大學;2015年

2 劉寶靜;人類線粒體基因組CpG甲基化模式[D];河北醫(yī)科大學;2015年

3 郝婧;兩種螽斯線粒體全基因組序列測定及譜系基因組學分析[D];陜西師范大學;2015年

4 陳亞莉;兩種蜻蜓全線粒體基因組的高通量測序及蜻蜓目系統(tǒng)發(fā)育分析[D];陜西師范大學;2015年

5 宋晶睿;五種螟蛾線粒體基因組序列的測定及螟蛾總科系統(tǒng)發(fā)育研究[D];陜西師范大學;2015年

6 周飛;四種蝗蟲線粒體基因組測定及直翅目系統(tǒng)發(fā)生分析[D];陜西師范大學;2015年

7 張惠仙;兩種鱗翅目昆蟲線粒體基因組的測序與分析[D];浙江師范大學;2015年

8 王悅;兩種鳳蝶線粒體基因組及分子進化研究[D];山西大學;2015年

9 易杰群;兩種蟲草寄主蝠蛾線粒體基因組特征及系統(tǒng)發(fā)育研究[D];南昌大學;2015年

10 李景艷;福爾馬林固定樣本線粒體基因組的測定及基于線粒體基因組和核基因位點鱘形目系統(tǒng)進化關系的研究[D];上海海洋大學;2015年

  本文關鍵詞：多種核酸擴增技術研究及其在線粒體DNA檢測中的應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：298967