目的:通過(guò)小分子干擾RNA（SiRNA）和短發(fā)夾RNA（ShRNA）兩種方法沉默F(xiàn)OXD3基因,研究該基因與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其作用機(jī)制。方法:（1）利用SiRNA沉默HCT116和Caco₂細(xì)胞中FOXD3基因的表達(dá),通過(guò)Quantitative Real Time-PCR（qRT-PCR）和Western Blot的方法檢測(cè)細(xì)胞中FOXD3在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況;（2）通過(guò)SRB實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwll實(shí)驗(yàn),檢測(cè)FOXD3基因沉默后,細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力的變化;（3）利用流式細(xì)胞檢測(cè)儀,分別用PI單染和Annexin V-FITC/PI雙染的方法,對(duì)FOXD3基因沉默后細(xì)胞周期和凋亡的變化進(jìn)行檢測(cè)。（4）采用Western Blot的方法,檢測(cè)FOXD3基因沉默后,細(xì)胞增殖相關(guān)的EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路蛋白、細(xì)胞遷移EMT過(guò)程相關(guān)的E-cadherin/N-cadherin蛋白,細(xì)胞凋亡相關(guān)的caspase3凋亡標(biāo)志蛋白的變化情況。（5）構(gòu)建ShFOXD3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下種植瘤實(shí)驗(yàn)。4周后,處死裸... 

【文章來(lái)源】：廣西醫(yī)科大學(xué)廣西壯族自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：92 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
個(gè)人簡(jiǎn)歷
摘要
Abstract
前言
第一章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        1.2 常用試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 主要溶劑配制
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 RNA干擾
        2.3 基因過(guò)表達(dá)
        2.4 建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株
        2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.6 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)
        2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)
        2.8 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)
        2.9 免疫組化實(shí)驗(yàn)
        2.10 組織蘇木精-伊紅染色
        2.11 SRB法檢測(cè)細(xì)胞活性
        2.12 細(xì)胞周期檢測(cè)
        2.13 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
        2.14 數(shù)據(jù)整理以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    第一節(jié) FOXD3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖
        1.1 FOXD3在結(jié)腸癌細(xì)胞中低表達(dá)
        1.2 SiRNA對(duì)FOXD3 mRNA和蛋白的抑制作用
        1.3 沉默F(xiàn)OXD3促進(jìn)細(xì)胞增殖
        1.4 沉默F(xiàn)OXD3加快細(xì)胞周期
        1.5 本節(jié)小結(jié)
    第二節(jié) FOXD3促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡
        2.1 沉默F(xiàn)OXD3抑制細(xì)胞凋亡
        2.2 沉默F(xiàn)OXD3抑制Caspase3切割
        2.3 本節(jié)小結(jié)
    第三節(jié) FOXD3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移
        3.1 沉默F(xiàn)OXD3促進(jìn)細(xì)胞遷移
        3.2 沉默F(xiàn)OXD3活化EMT相關(guān)信號(hào)通路
        3.3 本節(jié)小結(jié)
    第四節(jié) FOXD3抑制EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路
        4.1 沉默F(xiàn)OXD3活化EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路
        4.2 沉默F(xiàn)OXD3通過(guò)EGFR引起MAPK信號(hào)通路變化
        4.3 細(xì)胞恢復(fù)實(shí)驗(yàn)證明FOXD3抑制MAPK信號(hào)通路
        4.4 本節(jié)小結(jié)
    第五節(jié) 小鼠皮下種植瘤和病人腫瘤組織中FOXD3低 表達(dá) ，EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路蛋白高表達(dá)
        5.1 小鼠皮下種植瘤實(shí)驗(yàn)中抑制FOXD3能 夠活化EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路
        5.2 病人腫瘤組織中FOXD3低表達(dá)，EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路蛋白高表達(dá)
        5.3 本節(jié)小結(jié)
第三章 總結(jié)與討論
參考文獻(xiàn)
綜述
    第一節(jié) RAS基因概述
    第二節(jié) RAS突變與腫瘤
    第三節(jié) RAS作為藥物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
    第四節(jié) RAS作為藥物靶點(diǎn)的治療策略
    第五節(jié) 小結(jié)與展望
    綜述參考文獻(xiàn)
附錄 縮略語(yǔ)表
致謝
本課題獲得以下國(guó)家自然科學(xué)基金資助
碩士期間發(fā)表SCI文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]RAS-GTPase活化蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展[J]. 張紅凱,陳杰.  中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào). 2015(03)
[2]Colorectal carcinogenesis-update and perspectives[J]. Hans Raskov,Hans-Christian Pommergaard,Jakob Burcharth,Jacob Rosenberg.  World Journal of Gastroenterology. 2014(48)



本文編號(hào)：2965887