目的:通過小分子干擾RNA（SiRNA）和短發(fā)夾RNA（ShRNA）兩種方法沉默F(xiàn)OXD3基因,研究該基因與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其作用機制。方法:（1）利用SiRNA沉默HCT116和Caco₂細胞中FOXD3基因的表達,通過Quantitative Real Time-PCR（qRT-PCR）和Western Blot的方法檢測細胞中FOXD3在RNA水平和蛋白水平的表達情況;（2）通過SRB實驗、克隆形成實驗和Transwll實驗,檢測FOXD3基因沉默后,細胞的增殖能力和侵襲能力的變化;（3）利用流式細胞檢測儀,分別用PI單染和Annexin V-FITC/PI雙染的方法,對FOXD3基因沉默后細胞周期和凋亡的變化進行檢測。（4）采用Western Blot的方法,檢測FOXD3基因沉默后,細胞增殖相關(guān)的EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號通路蛋白、細胞遷移EMT過程相關(guān)的E-cadherin/N-cadherin蛋白,細胞凋亡相關(guān)的caspase3凋亡標志蛋白的變化情況。（5）構(gòu)建ShFOXD3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株,對裸鼠進行皮下種植瘤實驗。4周后,處死裸... 

【文章來源】：廣西醫(yī)科大學(xué)廣西壯族自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
個人簡歷
摘要
Abstract
前言
第一章 實驗材料與方法
    第一節(jié) 實驗材料
        1.1 實驗細胞
        1.2 常用試劑
        1.3 主要儀器
        1.4 主要溶劑配制
    第二節(jié) 實驗方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 RNA干擾
        2.3 基因過表達
        2.4 建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株
        2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR
        2.6 Transwell小室遷移實驗
        2.7 克隆形成實驗
        2.8 蛋白免疫印跡實驗
        2.9 免疫組化實驗
        2.10 組織蘇木精-伊紅染色
        2.11 SRB法檢測細胞活性
        2.12 細胞周期檢測
        2.13 細胞凋亡檢測
        2.14 數(shù)據(jù)整理以及統(tǒng)計學(xué)分析
第二章 實驗結(jié)果與分析
    第一節(jié) FOXD3抑制結(jié)腸癌細胞增殖
        1.1 FOXD3在結(jié)腸癌細胞中低表達
        1.2 SiRNA對FOXD3 mRNA和蛋白的抑制作用
        1.3 沉默F(xiàn)OXD3促進細胞增殖
        1.4 沉默F(xiàn)OXD3加快細胞周期
        1.5 本節(jié)小結(jié)
    第二節(jié) FOXD3促進結(jié)腸癌細胞凋亡
        2.1 沉默F(xiàn)OXD3抑制細胞凋亡
        2.2 沉默F(xiàn)OXD3抑制Caspase3切割
        2.3 本節(jié)小結(jié)
    第三節(jié) FOXD3抑制結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移
        3.1 沉默F(xiàn)OXD3促進細胞遷移
        3.2 沉默F(xiàn)OXD3活化EMT相關(guān)信號通路
        3.3 本節(jié)小結(jié)
    第四節(jié) FOXD3抑制EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號通路
        4.1 沉默F(xiàn)OXD3活化EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號通路
        4.2 沉默F(xiàn)OXD3通過EGFR引起MAPK信號通路變化
        4.3 細胞恢復(fù)實驗證明FOXD3抑制MAPK信號通路
        4.4 本節(jié)小結(jié)
    第五節(jié) 小鼠皮下種植瘤和病人腫瘤組織中FOXD3低 表達 ，EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號通路蛋白高表達
        5.1 小鼠皮下種植瘤實驗中抑制FOXD3能 夠活化EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號通路
        5.2 病人腫瘤組織中FOXD3低表達，EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK信號通路蛋白高表達
        5.3 本節(jié)小結(jié)
第三章 總結(jié)與討論
參考文獻
綜述
    第一節(jié) RAS基因概述
    第二節(jié) RAS突變與腫瘤
    第三節(jié) RAS作為藥物靶點的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
    第四節(jié) RAS作為藥物靶點的治療策略
    第五節(jié) 小結(jié)與展望
    綜述參考文獻
附錄 縮略語表
致謝
本課題獲得以下國家自然科學(xué)基金資助
碩士期間發(fā)表SCI文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]RAS-GTPase活化蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展[J]. 張紅凱,陳杰.  中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報. 2015(03)
[2]Colorectal carcinogenesis-update and perspectives[J]. Hans Raskov,Hans-Christian Pommergaard,Jakob Burcharth,Jacob Rosenberg.  World Journal of Gastroenterology. 2014(48)



本文編號：2965887