目的:基于高通量測(cè)序技術(shù)探討微小RNA（miRNA）在竇性心律（Sinus Rhythm,SR）及心房顫動(dòng)（Atrial fibrillation,AF）患者血漿外泌體中的表達(dá)差異,尋找可能和房顫發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的潛在標(biāo)志物,初步探索其生物學(xué)作用。方法:1.本研究篩選2018-06至2019-06至某院就診的患者為研究對(duì)象,其中房顫組（AF Group）患者26人,竇性心律組（SR Group）23人,統(tǒng)計(jì)臨床資料,根據(jù)房顫發(fā)作持續(xù)時(shí)間分為陣發(fā)性心房顫動(dòng)組（Paroxysmal AF Group,PaAF,n=13）及持續(xù)性心房顫動(dòng)組（Persistent AF Group,PeAF,n=13）。2.提取血漿外泌體,透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài),粒徑檢測(cè),蛋白印跡法（Western Blot,WB）檢測(cè)表面標(biāo)志蛋白。3.每組隨機(jī)選取3例,采用高通量測(cè)序技術(shù)獲取外泌體miRNA差異表達(dá)譜,查找文獻(xiàn),采用生信學(xué)分析篩選出和心血管疾病相關(guān)的目標(biāo)miRNA。4.對(duì)SR組（n=20）及AF組（n=20）患者,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（qPCR）驗(yàn)證目標(biāo)miRNA,使用受試者工作特征曲線（Receiv... 

【文章來(lái)源】：蚌埠醫(yī)學(xué)院安徽省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

外泌體粒徑分析圖

142.2外泌體粒徑檢測(cè)每例樣本進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果取三次平均值，粒徑分析圖如圖2所示。如表4所示，3組見(jiàn)平均粒徑和粒徑范圍百分比在相同水平上，直徑在30-150nm占所有囊泡83%左右，直徑在30-200nm占所有囊泡90%左右，說(shuō)明獲得的囊泡直徑較均一，純度較高。表4各組外泌體粒徑分析結(jié)果Tab.4Resultsofexosomalparticlesizeanalysisineachgroup注：此標(biāo)本粒徑主峰為50nm，次峰值為150nm圖2外泌體粒徑分析圖Fig.2Analysisofexosomalparticlesize2.3外泌體表面標(biāo)志蛋白結(jié)果在SR組、PaAF組、PeAF組隨機(jī)抽選的樣本1例，編號(hào)分別為：2317、2323、2330。采用WB法檢測(cè)外泌體表面標(biāo)記蛋白：CD9、CD63、TSG101。3組間CD9、CD63、TSG101均有條帶，說(shuō)明純化所得為外泌體。組別平均粒徑粒徑主峰(nm)30-150nm百分比(%)30-200nm百分比(%)SR組93.348.781.7291.89PaAF組9350.385.9493.13PeAF組88.947.082.2889.55圖3外泌體標(biāo)志蛋白Westernblot結(jié)果Fig.3Westernblotresultsofexosomalmarkerproteinsineachgroup

153數(shù)據(jù)質(zhì)控本項(xiàng)目使用BGISEQ-500平臺(tái)共測(cè)了9例樣品，每例樣品平均產(chǎn)出24.54M數(shù)據(jù)，共檢測(cè)到3280個(gè)miRNA。樣品比對(duì)基因組的平均比對(duì)率為86.59%。計(jì)算樣品間所有基因表達(dá)量的Pearson相關(guān)系數(shù)并繪制熱圖，如圖4所示，3組內(nèi)基因表達(dá)量Pearson相關(guān)系數(shù)均>0.8，說(shuō)明組內(nèi)樣品間基因表達(dá)水平相似。將每個(gè)標(biāo)本cleanreads比對(duì)到參考基因組序列，結(jié)果如表5所示，比對(duì)基因組占比最低為標(biāo)本SR3，為79.01%，說(shuō)明獲取的cleanreads質(zhì)量較高。如圖5所示，長(zhǎng)度在21-22nt的RNA有一小峰值，表明我們提取的小RNA中miRNA序列純度較高。注：X、Y軸均代表每個(gè)樣品；顏色代表相關(guān)性系數(shù)(顏色越深代表相關(guān)性越高，顏色越代表相關(guān)性越低)；0.8-1.0極強(qiáng)相關(guān)；0.6-0.8強(qiáng)相關(guān)。圖4各組基因表達(dá)量相關(guān)性熱圖Fig.4Correlationheatmapofgeneexpressionineachgroup注：X軸表示小RNA長(zhǎng)度(測(cè)序得到的片段去除接頭后的長(zhǎng)度)，Y軸表示該長(zhǎng)度小RNA占所有小RNA數(shù)量百分比。該圖反映直接測(cè)序得到的小RNA長(zhǎng)度分布情況。圖5各組小RNA長(zhǎng)度分布圖Fig.5DistributionofsmallRNAlengthsineachgroup


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