發(fā)布時間：2020-11-21 15:44

　　 目的本研究旨在探討X射線對心臟成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CFs)的影響,以及丹參酮ⅡA磺酸鈉(sodium tanshinone ⅡA sulfonate,STS)是否在以上過程中有作用及其可能的分子機制。方法使用差速離心法從Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠中提取CFs,免疫熒光法鑒定CFs的蛋白分子標(biāo)記后,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞隨機分組后,分別經(jīng)0.5、1、2、4Gy的X射線照射處理,克隆形成實驗測定細(xì)胞克隆數(shù)目并確定X射線造成細(xì)胞損傷模型的放射劑量。細(xì)胞用不同的STS濃度(2.5、5、10、20μg/mL)預(yù)處理,MTT法分析STS對CFs的增殖作用。微孔板法測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出量確定X射線對CFs的損傷作用以及STS對CFs的保護(hù)作用。確定細(xì)胞分組:空白對照0+0組;4+0組;4+2.5組;4+5組;4+10組;4+20組。流式分析測定活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,微孔板法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平含量來確定細(xì)胞氧化狀態(tài)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定細(xì)胞上清液中B型尿鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP),血管生成素-2(angiotensin II,Ang II)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡。Western blot檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白及p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.細(xì)胞純度鑒定:用免疫熒光鑒定CFs,波形蛋白抗原表達(dá)為陽性,細(xì)胞純度為97.5%±1.3%。2.細(xì)胞克隆形成實驗:與對照組相比,經(jīng)照射后的CFs克隆形成率呈劑量依賴性明顯降低(P0.05);其中經(jīng)4Gy照射后細(xì)胞形成克隆數(shù)目最低(P0.05)。3.細(xì)胞活力檢測:MTT測定結(jié)果表明,與對照組相比,STS預(yù)處理24h、48h(2.5、5、10、20μg/mL)細(xì)胞活力均增加(P0.05),48h、20μg/mL STS預(yù)處理后細(xì)胞活力增加最顯著(P0.05)。LDH測定結(jié)果表明,隨著放射劑量增加,LDH漏出量呈劑量依賴性明顯增高(P0.05);與4+0放射組相比,STS預(yù)處理組(2.5、5、10、20μg/mL)LDH含量明顯降低(P0.05);與0+0組相比,STS預(yù)處理后LDH含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.氧化損傷相關(guān)檢測:與0+0組相比,4+0組SOD含量明顯降低,ROS陽性率明顯升高(P0.05);與4+0組相比,STS預(yù)處理組(4+5、4+10、4+20)SOD升高,ROS陽性率降低(P0.05)。與0+0組相比,4Gy X射線照射后MDA含量降低,STS預(yù)處理后MDA含量降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.細(xì)胞分泌水平檢測:與0+0組相比,4+0組Ang II、BNP水平增加(P0.05),STS預(yù)處理后Ang II水平呈劑量依賴性降低(P0.05),BNP水平從4+5組開始降低,4+20組顯著降低(P0.05)。VEGF水平在X射線與STS干預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡:與0+0組相比,4+0組S期細(xì)胞周期阻滯;與4+0組相比,STS預(yù)處理組S期細(xì)胞比例降低,其中4+5組、4+10組、4+20組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與0+0組相比,4+0組細(xì)胞凋亡增加,STS預(yù)處理后,細(xì)胞凋亡率顯著降低,4+5組、4+10組、4+20組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),4+20組與0+0組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。7.Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)量:與0+0組相比,X射線導(dǎo)致p38,B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma/leukmia-2 associated X protein,Bax),caspase-3的表達(dá)增加以及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukmia-2,Bcl-2)的表達(dá)減少,磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05);與4+0組相比,STS預(yù)處理組caspase-3、Bax/Bcl-2、p-p38蛋白相對表達(dá)量顯著下調(diào),p-ERK 1/2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。結(jié)論X射線可引起CFs損傷,而STS對X射線引起的細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。X射線增加CFs的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,改變細(xì)胞周期,其潛在機制可能與Ang II和BNP的分泌減少以及p38 MAPK信號通路激活、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加有關(guān)。STS通過抑制上述分子變化減輕X射線對的CFs損傷,并且CFs可能是心血管藥物多效性作用的重要靶點,具體機制需要進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R285.5
【部分圖文】：

丹參酮ⅡA磺酸鈉對X射線誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞損傷的影響及機制的體外研究19表7LDH漏出量評估X射線輻射和STS治療對CFs損傷以及保護(hù)作用Doseofradiation(Gy)+STSconcentrations(μg/mL)TherelativecontentofLDHrelease(M±SD)AdjustedPValue0+01.01±0.1540.5+01.95±0.104<0.0001*1+02.10±0.170<0.0001*2+02.67±0.093<0.0001*4+02.89±0.128<0.0001*4+2.52.25±0.072<0.0001#4+51.86±0.121<0.0001#4+101.28±0.015<0.0001#4+201.03±0.006<0.0001#,>0.9999*注：*，與0+0對照組相比;#，與4+0組相比；P<0.05,表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義；LDH，乳酸脫氫酶。注：*P<0.05，**P<0.01與對照組24h相比；#P<0.05，##P<0.01與對照組48h相比；※P<0.0524h與48h相比。圖2MTT法檢測STS對細(xì)胞活力的影響

丹參酮ⅡA磺酸鈉對X射線誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞損傷的影響及機制的體外研究21注：**P<0.01與0+0對照組相比;##P<0.01與4+0組相比;NS,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LDH，乳酸脫氫酶。圖4LDH漏出量評估X射線輻射和STS治療對CFs損傷以及保護(hù)作用4.結(jié)論X射線可誘導(dǎo)CFs損傷，STS對CFs有保護(hù)作用，同時后續(xù)實驗選擇4GyX射線建立CFs的放射損傷模型。

丹參酮ⅡA磺酸鈉對X射線誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞損傷的影響及機制的體外研究34注：**P<0.01與0+0對照組比較；#P<0.05and##P<0.01與4+0組比較；NS：差異無統(tǒng)計學(xué)意義。AngⅡ，血管緊張素II；BNP，B型尿鈉肽；VEGF，血管內(nèi)皮生長因子。（A）AngII分泌水平，（B）BNP分泌水平，（C）VEGF分泌水平。圖6X射線照射對CFs分泌水平的影響以及STS干預(yù)后的改變
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2893234