研究目的肺纖維化是在肺部疾病中常見的一種典型的病理特征。硫化氫(H_2S)被認(rèn)為是繼一氧化氮和一氧化碳之后氣體信號分子家族的第三個成員,它在包括炎癥,代謝紊亂和血壓調(diào)節(jié)等許多生理和病理生理過程中都起著極其重要的作用。我們前期的實驗結(jié)果表明,H_2S供體NaHS在在體和離體情況下都可以逆轉(zhuǎn)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中發(fā)生的細(xì)胞衰老從而改善肺纖維化。本研究的目的是深入了解H_2S通過抑制肺泡上皮細(xì)胞衰老改善肺纖維化的機(jī)制。研究方法構(gòu)建CBS基因敲除小鼠,通過WB檢測肺組織中P53、P21的表達(dá),通過Masson染色觀察肺組織纖維化的程度,然后利用免疫熒光觀察肺組織中衰老相關(guān)蛋白P53、P21和SPC的共染情況。收集經(jīng)博來霉素干預(yù)過的L2細(xì)胞的上清液作用于小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)。運(yùn)用WB檢測成纖維細(xì)胞中α-SMA和纖維黏連蛋白(Fibronectin)的蛋白表達(dá),用PCR檢測成纖維細(xì)胞中增殖特異性基因Aurkb、Ccnb1、Cdc25b和Foxm1 mRNA的表達(dá)。為了了解P53在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中的關(guān)鍵作用,使用P53抑制劑和硫化氫處理L2細(xì)胞,通過檢測細(xì)胞中的P21蛋白表達(dá)和SA-β-gal衰老染色了解細(xì)胞衰老的情況。通過免疫共沉淀了解P53和MDM2之間的相互作用以及H_2S處理后P53的泛素化降解情況。最后對經(jīng)過BLM和H_2S處理過的小鼠肺組織進(jìn)行硫巰基化處理,明確H_2S的硫巰基化作用。研究結(jié)果1)H_2S合成酶CBS敲除使小鼠肺內(nèi)P53和P21表達(dá)增加并誘導(dǎo)肺纖維化;2)H_2S供體NaHS抑制ATII細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的相互作用;3)P53抑制劑抑制P53/P21和SASP基因的表達(dá)減輕L2細(xì)胞衰老;4)H_2S通過硫巰基化增強(qiáng)MDM2和P53的相互作用及P53的泛素化降解。研究結(jié)論H_2S可以抑制NIH3T3的異常增殖,并通過使MDM2硫巰基化促進(jìn)P53泛素化降解來改善細(xì)胞衰老從而逆轉(zhuǎn)肺纖維化。
【學(xué)位單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R563
【部分圖文】：

硫化氫通過硫巰基化MDM2抑制肺上皮細(xì)胞衰老從而改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化224.統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SD±SEM）形式表示，使用SPSS20.0分析數(shù)據(jù)。組間比較運(yùn)用單因素方差分析（ANOVA）方法，P＜0.05代表有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。5.研究結(jié)果5.1H2S合成酶CBS敲除可誘導(dǎo)II型肺上皮細(xì)胞衰老和肺纖維化如前所述，博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中衰老標(biāo)志物P53、P21的表達(dá)隨時間延長顯著增加，而H2S合成酶CBS和CSE的表達(dá)都隨時間的表達(dá)而減少，這表明博來霉素可以誘導(dǎo)小鼠肺組織細(xì)胞的衰老和內(nèi)源性H2S的減少。為了明確組織的衰老和H2S的減少是否有直接關(guān)系，我們構(gòu)建了CBS敲除小鼠以研究兩者之間的關(guān)系。在這部分實驗中，我們將動物分成兩組：野生型組和CBS基因部分敲除兩組。圖1-1H2S合成酶CBS敲除后肺纖維化形成注：圖為是Masson染色（標(biāo)尺為50um）及氣CBS敲除后肺纖維化面積/肺實質(zhì)面積的比值，與Control相比，**P＜0.01。首先通過Masson染色觀察小鼠肺組織纖維化情況。結(jié)果表明CBS敲除后肺組織中藍(lán)色膠原沉淀明顯增多，肺泡壁的厚度亦明顯增加，這表明與野生型小鼠相比，CBS敲除小鼠肺組織的纖維化面積明顯增加。

CBS敲除后肺組織中P53/P21/CSE表達(dá)變化

硫化氫通過硫巰基化MDM2抑制肺上皮細(xì)胞衰老從而改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化24圖1-3CBS敲除誘導(dǎo)的小鼠肺組織衰老注：紅色熒光標(biāo)記的是SPC(Cy3)，綠色熒光標(biāo)記的是P53/P21(FITC)，藍(lán)色標(biāo)記為細(xì)胞核（DAPI），圖中標(biāo)尺為50um。P53/P21標(biāo)記ATII細(xì)胞與ATII細(xì)胞總量比值，**P<0.01.更進(jìn)一步的免疫熒光結(jié)果也顯示，CBS敲除的小鼠肺組織中P53和P21的含量明顯增高。5.2外源性H2S對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中P53/P21表達(dá)的影響
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本文編號：2893201