本文關鍵詞：益生菌鼠李糖乳桿菌GG菌株發(fā)酵液對酒精性肝病保護機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：酒精性肝病(Alcoholic liver disease, ALD)是指由于長期大量飲酒所導致的一系列肝臟病變,在全球范圍內(nèi)都有著極高的發(fā)病率和致死率。長期慢性的酒精攝入可引起腸道微生物菌群的嚴重失調(diào)并破壞腸道的天然屏障功能,造成腸源性內(nèi)毒素在血液中含量的大幅增加,激活肝臟巨噬細胞啟動多種促炎因子的表達以及氧化壓力的產(chǎn)生,導致肝臟脂肪性變性和肝細胞受損。針對調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡,增強腸道屏障功能,從而預防酒精性肝損傷的研究,已經(jīng)成為熱點。益生菌是一類能夠為宿主提供健康效益的活性微生物,其能夠在腸道內(nèi)定植的特性使得益生菌在維護腸道菌群平衡,調(diào)節(jié)腸道上皮細胞緊密連結(jié)中起到至關重要的作用。實驗室前期研究表明,鼠李糖乳桿菌GG (Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)能夠有效抑制腸道有害細菌的過度生長,修復受損的腸道屏障,從而抑制酒精引起的內(nèi)毒素血癥的發(fā)生,阻斷內(nèi)毒素介導的肝臟脂肪化以及相應炎癥的產(chǎn)生。盡管益生菌治療酒精性肝病的有效性已經(jīng)被越來越多的臨床試驗所證明,但同時,對于免疫力低下以及腸道功能受損的病人,采用大量活菌治療也存在一定的危險性和不確定性。本論文就LGG滅活的菌株發(fā)酵上清液LGGs(Lactobacillus rhamnosus GG supernatant)對酒精性肝病是否具有保護作用以及其具體作用機制進行了研究。通過構建小鼠慢性酒精性肝損傷模型,對LGGs在長期酒精攝入的情況下對肝臟的影響進行探究,實驗結(jié)果表明,LGGs能夠有效緩解肝臟細胞的脂肪性變性,顯著抑制肝臟巨噬細胞激活的相關炎癥反應。在對小鼠腸道樣本的分析以及血清酶學檢測中發(fā)現(xiàn),LGGs對酒精引起的腸道上皮細胞通透性的增加具有顯著抑制作用,能夠有效阻止內(nèi)毒素血癥的發(fā)生,從一定程度上預防和緩解酒精攝入引起的肝損傷。進一步的,本課題利用人結(jié)腸癌上皮細胞系構建酒精性腸道上皮屏障損傷模型,對LGGs降低腸道上皮細胞通透性,增強屏障功能的具體機制進行探究。研究發(fā)現(xiàn),LGGs能夠通過抑制miR122a在腸道中的表達,促進腸道上皮細胞緊密連接蛋白Occludin的分泌,從而加強腸道上皮細胞間的屏障功能。此外,實驗室前期研究表明,酒精攝入引起缺氧誘導因子(HIF)的表達大幅降低,HIF是細胞缺氧適應及炎癥發(fā)展的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。酒精導致由HIF介導的對腸粘膜的再生和修復有重要作用的腸三葉因子(ITF)的表達受阻,破壞腸道的天然屏障。而LGG被證明能夠抑制酒精對HIF表達的影響,促進腸道杯狀細胞釋放ITR修復受損的腸道屏障。本論文對HIF所介導的兩個主要腸道屏障相關蛋白ITF以及Cathelin相關抗菌肽(CRAMP)的功能進行探究,發(fā)現(xiàn)ITF能夠有效抑制血小板活化因子(PAF)引起的腸道上皮細胞通透性升高,而CRAMP則對不同種類的細菌表現(xiàn)出選擇性抑菌作用：大腸桿菌、李斯特菌等致病菌的生長被顯著抑制而LGG則生長狀況良好。另外,本論文對益生菌的重要代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFA)家族中的丁酸(butyrate)對HIF表達的調(diào)節(jié)作用進行初步研究,實驗結(jié)果表明,丁酸鹽(NaB)能夠大幅提升鐵螯合劑(DFO)誘導的HIF表達的升高,表明益生菌有可能通過分泌短鏈脂肪酸這一類有益代謝物來調(diào)節(jié)腸道屏障。本研究對于更好地理解酒精性肝病致病機理以及益生菌對酒精性肝病保護作用的具體機制具有重大意義,為酒精性肝病的預防和治療提供了新的思路和手段。
【關鍵詞】：酒精性肝病 益生菌 腸上皮細胞緊密連結(jié) 缺氧誘導因子
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 英文縮略12-13
• 第一章 緒論13-22
• 1.1 酒精性肝病概況13
• 1.2 酒精性肝病發(fā)病機制13-16
• 1.2.1 酒精及其代謝產(chǎn)物引起的肝細胞損傷14
• 1.2.2 氧化應激與脂質(zhì)過氧化14-15
• 1.2.3 腸源性內(nèi)毒素介導的肝臟損傷15-16
• 1.3 酒精性肝病的診斷和治療16-17
• 1.3.1 傳統(tǒng)治療手段16-17
• 1.3.2 新型療法17
• 1.4 益生菌在酒精性肝病中的應用17-19
• 1.4.1 益生菌定義17-18
• 1.4.2 益生菌在肝臟疾病中的應用18-19
• 1.5 腸道屏障作用19-21
• 1.5.1 腸道屏障的組成19-20
• 1.5.2 miR122a對腸道屏障的調(diào)控20
• 1.5.3 缺氧誘導因子以及短鏈脂肪酸20-21
• 1.6 研究內(nèi)容和意義21-22
• 第二章 實驗材料和方法22-31
• 2.1 酒精性肝損傷以及LGGs治療酒精性肝損傷的小鼠模型的構建22
• 2.1.1 小鼠模型的構建22
• 2.1.2 人結(jié)腸癌細胞Caco-2細胞的培養(yǎng)22
• 2.2 實驗材料22-25
• 2.2.1 實驗所用菌株22-23
• 2.2.2 實驗儀器23
• 2.2.3 實驗試劑23-24
• 2.2.4 實驗所用引物及菌株24-25
• 2.3 實驗方法25-31
• 2.3.1 血液生化分析25
• 2.3.2 肝臟甘油三酯檢測25
• 2.3.3 檢測肝臟中細胞因子的含量25
• 2.3.4 肝臟病理組織學分析25-27
• 2.3.5 肝臟脂肪分析,油紅O染色27
• 2.3.6 總RNA的提取以及實時熒光定量RT-PCR27-28
• 2.3.7 細胞及組織中總蛋白的提取28
• 2.3.8 BCA法測蛋白濃度28-29
• 2.3.9 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)分析29
• 2.3.10 跨上皮細胞電阻(TEER)的測定及FD-4滲透性實驗29
• 2.3.11 熒光素酶實驗29-30
• 2.3.12 統(tǒng)計學分析30-31
• 第三章 實驗結(jié)果31-44
• 3.1 LGGs在小鼠酒精肝模型中對肝臟的保護作用31-35
• 3.1.1 LGGs改善酒精喂養(yǎng)小鼠肝臟的脂肪變性31-34
• 3.1.2 LGGs有效緩解酒精引起的肝臟損傷34-35
• 3.2 LGGs對酒精引起腸道功能紊亂的影響35-39
• 3.2.1 LGGs對酒精引起的腸道滲透性變化的影響35-37
• 3.2.2 LGGs對腸道緊密連接蛋白的影響37-38
• 3.2.3 LGGs在回腸以及Caco-2細胞中對miR122a表達的影響38-39
• 3.3 缺氧誘導因子HIF調(diào)控的腸道屏障相關蛋白的功能研究39-44
• 3.3.1 抗菌肽CRAMP的選擇性抑菌作用39-41
• 3.3.2 腸三葉因子對Caco-2細胞腸道屏障完整性的作用41-42
• 3.3.3 丁酸對缺氧誘導因子的調(diào)控作用42-44
• 第四章 小結(jié)與討論44-47
• 4.1 小鼠肝臟及血清的病理分析44
• 4.2 LGGs通過抑制miR122a的表達上調(diào)Occludin表達44-45
• 4.3 缺氧誘導因子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的腸道屏障相關蛋白功能的初步研究45-47
• 參考文獻47-54
• 在讀期間科研成果54-55
• 致謝55

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