機(jī)體進(jìn)行正常生理和心理活動時需要規(guī)律和充足的睡眠。由于社會節(jié)奏加快,人們工作和生活壓力加大,致使現(xiàn)在越來越多的人遭受著不同程度的睡眠限制,并嚴(yán)重影響人們的正常生活。研究者們對睡眠限制的認(rèn)識,更多集中于大腦中神經(jīng)元的研究,近幾年得益于生物研究技術(shù)的發(fā)展,定居于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞在睡眠中發(fā)揮的功能正逐漸被人們認(rèn)識,但其在睡眠的生理功能和病理變化中發(fā)揮的作用還不清楚。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的維持者,小膠質(zhì)細(xì)胞具有不同的激活表型,并且在不同激活狀態(tài)下發(fā)揮不同的功能。結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞的突觸修剪功能,本研究通過建立青春期睡眠限制動物模型,揭示海馬區(qū)神經(jīng)元突觸可塑性的小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控機(jī)制,探索睡眠限制產(chǎn)生認(rèn)知及情緒功能損傷的作用原理,并提出一種潛在的睡眠不足導(dǎo)致認(rèn)知損傷的預(yù)防手段。本實(shí)驗(yàn)以青春期睡眠限制(Sleep Restriction,SR)的C57/BL小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?共分為3組:對照組(Control,Con)、睡眠限制組(Sleep Restriction,SR)、米諾環(huán)素組(SR+Mino)。睡眠限制時間為6 h/d,連續(xù)7天,米諾環(huán)素組給予腹腔注射米諾環(huán)素(20 mg/kg)。采用物體空間定位測試OLT、物體辨別測試NORT、新穎性抑制喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)NSFT檢測小鼠的認(rèn)知功能變化,利用RT-qPCR和Western blot免疫印跡檢測突觸后致密區(qū)蛋白PSD95及小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá),結(jié)合免疫熒光染色及共定位方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及突觸修剪功能改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)持續(xù)一周的睡眠限制引起小鼠認(rèn)知功能損傷以及小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,伴隨吞噬相關(guān)分子(TREM2,CD68)的表達(dá)增加,證明小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)吞噬能力增強(qiáng)型激活。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PSD95的蛋白水平明顯降低,并通過免疫熒光共定位技術(shù)發(fā)現(xiàn)睡眠限制導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞對PSD95吞噬能力增強(qiáng),伴隨神經(jīng)元活性異常,提示青春期小鼠睡眠限制后小膠質(zhì)細(xì)胞突觸修剪功能增強(qiáng),影響神經(jīng)元活性及功能異常。除此之外,小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抑制劑——米諾環(huán)素可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài),緩解神經(jīng)元PSD95丟失,并改善行為學(xué)異常,進(jìn)一步證明小膠質(zhì)細(xì)胞在睡眠限制過程中發(fā)揮作用。綜上所述,睡眠限制能夠激活青春期小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞,使其產(chǎn)生突觸修剪能力增強(qiáng)的應(yīng)激響應(yīng),影響神經(jīng)元突觸可塑性,導(dǎo)致神經(jīng)元活性異常,進(jìn)而損傷小鼠認(rèn)知功能。而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活可以部分改善長期睡眠限制導(dǎo)致的小鼠行為學(xué)異常。這為針對長期睡眠限制導(dǎo)致青少年認(rèn)知損傷的預(yù)防和治療提供了科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：電子科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R338
【部分圖文】：

第一章緒論1第一章緒論1.1研究背景1.1.1睡眠功能及睡眠不足的影響人有三分之一的時間在睡眠中度過，在機(jī)體發(fā)揮正常生理功能和進(jìn)行心理活動過程中，保證充足的睡眠尤為重要。目前對于睡眠的功能仍有爭議，但隨著研究技術(shù)手段的發(fā)展，許多關(guān)于睡眠的研究相繼被發(fā)表。在2015年Krueger等人對睡眠的功能進(jìn)行了總結(jié)，表明充足的睡眠可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低能量消耗并儲存機(jī)體能量，幫助淋巴系統(tǒng)清除體內(nèi)毒素和廢物，維持腦內(nèi)突觸連接，這其中也涉及到神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的聯(lián)系等[1]。隨著現(xiàn)代科技迅速發(fā)展，人們生活節(jié)奏不斷加快，工作壓力加大，致使現(xiàn)在越來越多的人遭受不同程度的睡眠限制。調(diào)查顯示急性睡眠剝奪會影響人的視覺、觸覺等感知能力[2]，致使人頭昏腦脹，注意力不集中，警覺性下降等[3]，嚴(yán)重時會導(dǎo)致醫(yī)療和交通事故。另外慢性睡眠剝奪會降低機(jī)體完成持續(xù)任務(wù)的能力，使其心情焦慮，免疫力降低，記憶力衰退，并可能伴隨如神經(jīng)衰弱、抑郁癥和焦慮癥等[4]各種神經(jīng)和精神疾病的發(fā)生（圖1-1）。圖1-1睡眠剝奪造成的危害[5]

電子科技大學(xué)碩士學(xué)位論文8圖1-3在健康大腦中神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞借助CX3CL1-CX3CR1相互作用[86]。（A）CX3CL1-CX3CR1促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元回路的募集。（B）CX3CL1-CX3CR1調(diào)節(jié)興奮性突觸的成熟、活性和可塑性。（C）CX3CL1-CX3CR1信號傳導(dǎo)可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞對新生凋亡細(xì)胞和突觸元件的吞噬作用來影響突觸發(fā)育和成年海馬神經(jīng)發(fā)生。綜上所述，小膠質(zhì)細(xì)胞依賴于不同的途徑發(fā)揮其突觸修剪的作用，對于突觸可塑性以及參與機(jī)體學(xué)習(xí)過程和環(huán)境改變的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重塑至關(guān)重要。本研究將聚焦于海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型及其吞噬功能，探究小膠質(zhì)細(xì)胞在睡眠限制中的突觸修剪功能變化，為緩解因睡眠限制引起的認(rèn)知功能損傷現(xiàn)象提供新的治療思路。1.2本文研究目的及內(nèi)容在當(dāng)今社會，由于工作和生活壓力增加，人們的睡眠問題愈發(fā)嚴(yán)重，其產(chǎn)生的不利影響也逐漸增多。睡眠問題不僅存在于社會壓力大的中年人和身體狀況愈下的老年人，也普遍存在于青少年群體中。睡眠不足的影響涉及范圍很廣，其嚴(yán)重影響到機(jī)體的正常生理功能，包括學(xué)習(xí)記憶能力，警惕性和反應(yīng)能力等。本研

第一章緒論9究通過建立小鼠睡眠限制模型，探索睡眠限制引起的認(rèn)知功能損傷機(jī)制及改善手段，研究小膠質(zhì)細(xì)胞表型及突觸修剪功能改變對認(rèn)知功能的貢獻(xiàn)，以提供關(guān)于改善睡眠不足有害影響的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和潛在治療策略。圖1-2本文研究思路結(jié)合已有的科研成果，在之前的研究基礎(chǔ)上，我們假設(shè)睡眠限制會激活小膠質(zhì)細(xì)胞，改變小膠質(zhì)細(xì)胞的表型，使其在睡眠限制過程中對神經(jīng)元的突觸修剪增加，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠的認(rèn)知功能受損，研究思路如圖1-2所示。本課題的研究內(nèi)容主要分為以下四個部分：（1）建立青春期小鼠睡眠限制模型，取小鼠大腦制作冰凍切片，通過免疫熒光染色技術(shù)，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化，檢測其激活狀態(tài)。通過實(shí)時熒光定量PCR檢測小膠質(zhì)細(xì)胞表面特異性分子TREM2和CD68的表達(dá)。利用免疫熒光共定位技術(shù)檢測CD68與小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白Iba1共定位現(xiàn)象，判定小膠質(zhì)細(xì)胞激活特征及其極化狀態(tài)。（2）檢測小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的相關(guān)分子表達(dá)，利用免疫熒光共定位技術(shù)，計算小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元興奮性突觸后蛋白共定位系數(shù)，進(jìn)一步檢測小膠質(zhì)細(xì)胞突觸修剪功能變化。（3）通過免疫熒光染色和Westernblot檢測睡眠限制對神經(jīng)元的影響，測定
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本文編號：2884650