背景和目的:增生性瘢痕(Hypertrophic scars,HTS)常導(dǎo)致機(jī)體功能障礙,目前的臨床治療效果不理想。瘢痕的形成過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡,即膠原蛋白的合成和降解,當(dāng)這種平衡被打破,則會(huì)形成病理性瘢痕,包括HTS。既往研究證實(shí)皮膚燒傷后的增生性瘢痕組織中肌成纖維細(xì)胞增多,肌成纖維細(xì)胞的增殖開(kāi)始于肉芽組織形成階段及活化的肌成纖維細(xì)胞聚集后,而這些作用在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積、過(guò)度上皮化和最終的傷口愈合過(guò)程中都起著重要作用。HTS的主要成分是collagen-1(Col1a1)和纖連蛋白(fibronectin),它們是參與細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,而α平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,αSMA)主要參與調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞的收縮。成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過(guò)程中起著重要作用,探索HTS發(fā)生的分子機(jī)制有助于增生性瘢痕的防治。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)是一種細(xì)胞因子,研究表明哺乳類(lèi)動(dòng)物中含有TGFβ1-TGFβ3的表達(dá)。TGFβ在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及組織纖維化中發(fā)揮重要作用,可促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合過(guò)程中肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。此外,TGFβ還參與了αSMA的形成過(guò)程,在傷口愈合過(guò)程中調(diào)節(jié)傷口收縮和增加ECM、膠原蛋白和纖粘連蛋白的表達(dá)等。包括在慢性潰瘍中,TGFβ1同樣參與調(diào)節(jié)皮膚角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖。既往文獻(xiàn)證實(shí),Smad蛋白作為T(mén)GFβ的下游蛋白在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮最重要的作用,研究發(fā)現(xiàn)腎臟、肺和肝臟中TGFβ1可通過(guò)細(xì)胞膜上異二聚體受體使轉(zhuǎn)錄因子Smad2/Smad3磷酸化發(fā)揮作用。線粒體內(nèi)Ca~(2+)攝取對(duì)調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞過(guò)程和能量代謝至關(guān)重要,Ca~(2+)是ROS產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)物,線粒體基質(zhì)中的Ca~(2+)超載會(huì)損害線粒體功能導(dǎo)致過(guò)量的ROS生成,而線粒體內(nèi)過(guò)低的Ca~(2+)濃度可導(dǎo)致ATP生成減少,這提示Ca~(2+)信號(hào)和ROS及ATP間存在功能性的聯(lián)系。線粒體作為最早被認(rèn)識(shí)的鈣庫(kù),其線粒體的外膜對(duì)Ca~(2+)有較好的通透性,內(nèi)膜具有高度的選擇通透性,在維持線粒體膜電位和氧化磷酸化中發(fā)揮著重要作用。線粒體丙酮酸脫氫酶(PDH)和數(shù)個(gè)電子轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物與維持線粒體Ca~(2+)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變有關(guān)。NADPH氧化酶(Nox)4利用NADPH中的離子生成過(guò)氧化物,抑制Nox4可減少多種組織損傷模型中肌成纖維細(xì)胞的形成和纖維化。最近研究表明TGFβ介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化已被證明與ROS生成增多激活Nox4有關(guān)。然而,線粒體內(nèi)Ca~(2+)超載通過(guò)ROS和Nox4/Smad3信號(hào)通路在調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用仍不清楚。瞬時(shí)受體電位(Transient Receptor Potential Channel,TRP)通道在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞增殖、遷移和炎癥中發(fā)揮重要作用。TRP通道是一類(lèi)對(duì)鈉、鈣等陽(yáng)離子通透的非選擇性陽(yáng)離子通道,它分為T(mén)RPCs,TRPVs及TRPMs等亞型,其中TRPC3是TRPCs亞家族成員之一。研究顯示TRP通道與成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及創(chuàng)傷愈合傷口收縮有關(guān)。TRPC6可激活細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)反應(yīng)蛋白鈣調(diào)磷酸激酶,從而誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及皮膚創(chuàng)面愈合,而TRPA1可促進(jìn)心肌梗死后心肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。我們之前的研究揭示TRPC3表達(dá)增加與單核細(xì)胞遷移增加及促進(jìn)線粒體Ca~(2+)攝取和ROS生成增加,這一系列的反應(yīng)與高血壓血管重構(gòu)有關(guān)。既往研究還顯示,TRPC6參與血小板活化與糖尿病高血糖激活TRPC6促進(jìn)血小板鈣內(nèi)流增加有關(guān)。也有研究表明TRPC3表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上,參與調(diào)控鈣庫(kù)操縱的鈣內(nèi)流(Store Operate Calcium Entry,SOCE)及線粒體Ca~(2+)穩(wěn)態(tài)。但TRPC3在增生性瘢痕中的表達(dá)及調(diào)控肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用尚不甚清楚。此外,目前對(duì)創(chuàng)傷時(shí)TGFβ1調(diào)控TRPC3介導(dǎo)線粒體鈣攝取和ROS生成,調(diào)控肌成纖維細(xì)胞分化的機(jī)制也尚不明確,有待進(jìn)一步深入闡明。本研究包括兩個(gè)部分:1.TRPC3在人增生性瘢痕中的表達(dá)。2.TRPC3調(diào)控成纖維細(xì)胞線粒體功能對(duì)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制。我們對(duì)門(mén)診就診的需要做皮膚增生性瘢痕切除術(shù)的患者納入本臨床研究,并簽署知情同意書(shū),采集患者的一般資料及對(duì)皮膚增生性瘢痕進(jìn)行《改良版溫哥華瘢痕量表評(píng)分》�；颊咝性錾择：矍谐g(shù)時(shí)收集新鮮的瘢痕組織標(biāo)本及酌情采集其周?chē)５钠つw組織或行整形美容手術(shù)切取的多余正常皮膚組織,采用免疫組化、qRT-PCR及Western Blot等技術(shù),明確TRPC3和TGFβ1在增生性瘢痕組織和正常皮膚組織中的表達(dá)水平。同時(shí),采用人和TRPC3基因敲除小鼠(Trpc3~(-/-))及野生型小鼠(Trpc3~(+/+))的原代培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞,檢測(cè)成纖維細(xì)胞的胞漿鈣離子濃度([Ca~(2+)]_i)和線粒體鈣攝取([Ca~(2+)]_m),檢測(cè)細(xì)胞及線粒體ROS及ATP生成,闡明TRPC3在增生性瘢痕中的作用,明確TRPC3通過(guò)調(diào)控NOX4/pSmad信號(hào)通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的機(jī)制,揭示TRPC3參與增生性瘢痕形成的機(jī)制。本研究為皮膚增生性瘢痕的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。材料和方法:整個(gè)研究包括離體實(shí)驗(yàn)和整體實(shí)驗(yàn)。第一部分離體實(shí)驗(yàn),臨床納入皮膚增生性瘢痕的患者,并對(duì)皮膚瘢痕進(jìn)行《改良版溫哥華瘢痕量表評(píng)分》。手術(shù)時(shí)收集患者的瘢痕組織及臨近的正常皮膚組織或行整形美容手術(shù)切取的多余正常皮膚組織為研究對(duì)象,采用免疫組化、qRT-PCR等技術(shù),明確TRPC3在人增生性瘢痕及正常皮膚組織中的表達(dá),及TRPC3的表達(dá)與瘢痕評(píng)分的相關(guān)性。第二部分整體實(shí)驗(yàn)以Trpc3~(-/-)小鼠和Trpc3~(+/+)小鼠作為研究對(duì)象,創(chuàng)建開(kāi)放性背部皮膚傷口模型,于創(chuàng)傷愈合過(guò)程中采集創(chuàng)面肉芽組織,闡明創(chuàng)面愈合過(guò)程TRPC3調(diào)控新生肉芽組織的肌成纖維細(xì)胞αSMA蛋白表達(dá)及對(duì)增生性瘢痕相關(guān)信號(hào)分子的作用及機(jī)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用人或Trpc3~(-/-)小鼠和Trpc3~(+/+)小鼠原代培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞,明確TRPC3調(diào)控線粒體鈣攝取及ROS生成的作用,闡明TRPC3調(diào)控NOX4/pSmad信號(hào)通路在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)主要方法如下:1.利用qRT-PCR、免疫印跡、免疫組化和免疫熒光染色等分子生物學(xué)技術(shù),檢測(cè)TRPC3、αSMA、TGFβ1、Fibronectin、Col1a1和Nox4/pSmad相關(guān)蛋白的表達(dá)及分布。2.采用原代培養(yǎng)的人或Trpc3~(-/-)小鼠和Trpc3~(+/+)小鼠成纖維細(xì)胞作為研究對(duì)象,以TRPC3特異性抑制劑Pyr3和TGFβ1作為藥物干預(yù)手段,利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胞漿鈣離子濃度和線粒體鈣攝取的變化。3.采用高分辨率線粒體功能測(cè)定儀及氧化還原試劑盒,測(cè)定成纖維細(xì)胞線粒體呼吸功能、ATP及ROS生成的情況。4.以Trpc3~(-/-)小鼠和Trpc3~(+/+)小鼠作為研究對(duì)象,在背部創(chuàng)建開(kāi)放性皮膚傷口模型,在傷口愈合過(guò)程中采集創(chuàng)面肉芽組織,采用免疫組化和免疫印跡法檢測(cè)TRPC3、αSMA、TGFβ1、fibronectin、Col1a1和Nox4/pSmad2/3通路的變化及作用機(jī)制。結(jié)果:1.與人正常皮膚組織相比較,人增生性瘢痕皮膚組織中TRPC3和TGFβ1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著增高,且TRPC3與TGFβ1的mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。2.成纖維細(xì)胞有TRPC3表達(dá),TGFβ1干預(yù)可顯著上調(diào)成纖維細(xì)胞TRPC3和αSMA蛋白表達(dá),促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,TRPC3抑制劑Pyr3可逆轉(zhuǎn)TGFβ1的這種作用。3.TGFβ1干預(yù)可顯著增加成纖維細(xì)胞胞漿鈣離子濃度([Ca~(2+)]_(cyt))和線粒體鈣([Ca~(2+)]_(mito))攝取,增加線粒體ROS生成,減少ATP合成,導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化和電子傳遞減弱。TRPC3抑制劑Pyr3干預(yù)可削弱TGFβ1的這種作用,改善線粒體呼吸功能。4.與Trpc3~(+/+)小鼠相比較,Trpc3~(-/-)小鼠創(chuàng)面肉芽組織肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物αSMA表達(dá)顯著減少。Trpc3~(-/-)小鼠原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞TGFβ1誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流也顯著減少。Trpc3~(-/-)小鼠創(chuàng)面肉芽組織αSMA、TGFβ1、Fibronectin、Col1a1和NOX4/pSmad2/3蛋白表達(dá)均顯著減少,提示TRPC3基因敲除可減少肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及增生性瘢痕形成。結(jié)論:1.人增生性瘢痕皮膚組織TRPC3和TGFβ1表達(dá)增加。2.TRPC3在成纖維細(xì)胞中表達(dá),TGFβ1可上調(diào)成纖維細(xì)胞TRPC3表達(dá)增加線粒體鈣攝取和ROS生成,促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。抑制TRPC3能夠部分逆轉(zhuǎn)TGFβ1的這種作用。3.TRPC3基因敲除能夠抑制TGFβ1誘導(dǎo)的SOCE,減少增生性瘢痕。TRPC3介導(dǎo)的Nox4/pSmad2/3信號(hào)通路是創(chuàng)傷后增生性瘢痕形成的機(jī)制之一。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：R622
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文19圖1-1TRPC3的分子結(jié)構(gòu)示意圖Figure1-1.TheThemolecularstructurediagramofTRPC31材料和方法1.1入選標(biāo)準(zhǔn)1.年齡≥18歲，無(wú)智力和語(yǔ)言障礙；瘢痕病程：≥6個(gè)月，≤12個(gè)月；2.瘢痕至少應(yīng)滿足下列2個(gè)條件：高出皮膚表面；顏色紅；質(zhì)地硬；3.患者無(wú)皮膚、免疫、傳染等全身性疾��；4.瘢痕表面無(wú)感染和潰瘍；5.無(wú)全身系統(tǒng)性纖維化病史；6.術(shù)前1年內(nèi)未使用過(guò)激素類(lèi)藥物，瘢痕局部未經(jīng)放射或注射治療及其他外用藥物治療。1.2排除標(biāo)準(zhǔn)1.已確診抑郁癥、精神分裂癥、腦血管性癡呆者。2.處于哺乳期或妊娠其婦女。3.既往有瘢痕疙瘩病史或家族史。4.不能配合治療及定期復(fù)查者。5.合并糖尿病等全身性代謝疾病或免疫系統(tǒng)存在缺陷影響創(chuàng)面愈合者。1.3研究方法共有21例增生性瘢痕的患者納入本研究。所有受試者的皮膚組織均取自陸軍

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文25圖1-1TRPC3、TGFβ1在人的正常皮膚組織及增生性瘢痕中的表達(dá)Figure1-1.ImmunohistochemicalstainingofTRPC3andTGFβ1expressioninhypertrophicscartissuesandnormalskintissues.Thescalebarrepresents100μminthe10×images.進(jìn)一步地采用qRT–PCR檢測(cè)增生性瘢痕和正常皮膚組織中TRPC3和TGFβ1的mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明增生性瘢痕組織中TRPC3mRNA和TGFβ1mRNA表達(dá)水平較正常皮膚組織顯著增高（p<0.05）（圖1-2，表1-1）。圖1-2TRPC3、TGFβ1mRNA在人的正常皮膚組織（normalskin）及增生性瘢痕(hypertrophicscar)中的表達(dá)Figure1-2.TRPC3andTGFβ1mRNAexpressionlevelsinnormalskintissuesandhypertrophicscartissuesbyqRT-PCR.*p<0.05,vsnormalskin.

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文25圖1-1TRPC3、TGFβ1在人的正常皮膚組織及增生性瘢痕中的表達(dá)Figure1-1.ImmunohistochemicalstainingofTRPC3andTGFβ1expressioninhypertrophicscartissuesandnormalskintissues.Thescalebarrepresents100μminthe10×images.進(jìn)一步地采用qRT–PCR檢測(cè)增生性瘢痕和正常皮膚組織中TRPC3和TGFβ1的mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明增生性瘢痕組織中TRPC3mRNA和TGFβ1mRNA表達(dá)水平較正常皮膚組織顯著增高（p<0.05）（圖1-2，表1-1）。圖1-2TRPC3、TGFβ1mRNA在人的正常皮膚組織（normalskin）及增生性瘢痕(hypertrophicscar)中的表達(dá)Figure1-2.TRPC3andTGFβ1mRNAexpressionlevelsinnormalskintissuesandhypertrophicscartissuesbyqRT-PCR.*p<0.05,vsnormalskin.
【參考文獻(xiàn)】

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1 柯昌能;郭小寶;劉坡;陳杰明;;增生性瘢痕瞬時(shí)受體電位通道香草醛亞型-1的表達(dá)及其意義[J];廣西醫(yī)學(xué);2015年08期

2 丁鳳云;蘭建云;劉洪;宋祥和;卞勇華;余宏宇;;病理性瘢痕組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2011年10期

本文編號(hào)：2873779