發(fā)布時間：2017-04-05 13:55

  本文關鍵詞：人參皂甙Rh2誘導小鼠黑色素瘤B16細胞自噬及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:惡性黑色素瘤的發(fā)病率僅占皮膚癌的5%左右,但其惡性程度高,轉移快,且對放療和化療均不敏感,所以預后極差,治療較為棘手。因此,研制一種提取自天然植物的且具有高敏感性的藥物來治療惡性黑色素瘤是各國學者努力的主要方向。近年來,提取自天然紅參根部的原人參二醇型低糖鏈皂甙單體-人參皂甙Rh2受到了學者們的廣泛關注。其抗腫瘤作用已經(jīng)得到眾多國內外學者的認同,但對其抗腫瘤機制的研究尚未完全研究透徹,如關于人參皂甙Rh2是否能夠誘導惡性黑色素瘤細胞發(fā)生自噬這一研究領域尚未見報道。因此,本文以小鼠惡性黑色素瘤B16細胞為研究對象,通過檢測自噬標志性蛋白-Beclin1和LC3來驗證人參皂甙Rh2是否參與誘導惡性黑色素瘤細胞發(fā)生自噬,同時探討人參皂甙Rh2是否是通過自噬經(jīng)典細胞信號轉導通路PI3K/Akt/mTOR來調控B16細胞的自噬。方法:1.采用MTT的方法分別檢測經(jīng)過人參皂甙Rh2干預24h、48h和72h后,B16細胞的OD值有何變化,并以此為基礎繪制其細胞增殖曲線圖,從而分別算取24h、48h和72h三個時間段中,人參皂甙Rh2對B16細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。2.以透射電鏡觀察以人參皂甙Rh2和自噬抑制劑處理B16細胞后,其生理狀態(tài)是否改變,主要是自噬小體數(shù)量的增減。3.分別提取人參皂甙Rh2干預前、后B16細胞的總蛋白,并以Western blot方法檢測其自噬死亡標志性蛋白-Beclin1表達的變化,同時,也檢測經(jīng)人參皂甙Rh2干預后,B16細胞的自噬經(jīng)典調控信號通路PI3K/Akt/mTOR中的主要效應分子Akt及mTOR活化水平的變化情況,并用Akt的抑制劑-魚藤素(Deguelin)和mTOR的抑制劑-雷帕霉素(Rapamycin)來反向驗證PI3K/Akt/mTOR細胞信號轉導通路為B16細胞的自噬調控機制之一。4.通過注射接種腫瘤的方式來建立小鼠的黑色素瘤模型,并通過動物體內實驗(免疫組化檢測Beclin1和自噬特征蛋白LC3基因的表達)證實人參皂甙Rh2能夠誘導B16小鼠黑色素瘤細胞產(chǎn)生自噬,并且安全較高,副作用低。結果:1.MTT檢測后,繪制的細胞增殖曲線結果表明,人參皂甙Rh2可以抑制B16細胞生長,且存在濃度和時間依賴性。其中48h的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為59.87±3.75μg/ml。2.經(jīng)過人參皂甙Rh2干預后的B16細胞與對照組細胞相比,細胞內自噬小體明顯增多。3.Western blot結果顯示,人參皂甙Rh2干預后的B16細胞,自噬死亡標志性蛋白Beclin1的表達較對照組升高明顯,而Akt和mTOR的活性均明顯降低。Akt抑制劑-魚藤素(Deguelin)處理組和魚藤素-人參皂甙組兩組的Beclin1蛋白表達水平均高于對照組,但單獨魚藤素組增高程度低于魚藤素+人參皂甙組,而Akt、mTOR活性降低。同樣的,mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)處理組和雷帕霉素-人參皂甙處理組兩組的Beclin1蛋白表達水平較野生對照組增高,而mTOR活性降低。4.免疫組化結果證明,經(jīng)人參皂甙Rh2干預后的小鼠,無論是接種腫瘤前給予藥物,還是注射腫瘤后再給予藥物,其腫瘤組織切片中的Beclin1蛋白與自噬標志性蛋白-LC3的表達水平均明顯高于未經(jīng)人參皂甙Eh2干預的接種腫瘤的小鼠。5.動物模型血常規(guī)、生化結果顯示,患有惡性黑色素瘤的小鼠,其白細胞有小幅上升,而中性粒細胞百分比上升明顯。相對的,它們的淋巴細胞百分比、紅細胞、血紅蛋白以及血小板則明顯下降,且谷丙和谷草轉氨酶均明顯升高。經(jīng)人參皂甙Rh2干預后,以上異常情況均得到相對改善。結論:在人參皂甙Rh2的干預下,B16細胞自噬標志性蛋白LC3和Beclin1明顯升高,因此人參皂甙Rh2可能通過誘導B16細胞產(chǎn)生自噬而達到其抑制腫瘤的作用。并且,其有可能是通過P13K/Akt/mTOR信號通路誘導B16細胞自噬。
【關鍵詞】：惡性黑色素瘤 自噬 PI3K/Akt/mTOR 信號通路
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• （一）前言11-13
• （二）材料和方法13-20
• 1. 材料13-16
• 2. 方法16-20
• 3. 統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理20
• （三）結果20-26
• （四）討論26-29
• （五）結論29-30
• （六）參考文獻30-32
• 綜述32-40
• 參考文獻38-40
• 致謝40-41

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本文編號：287081