本文關(guān)鍵詞：人參皂甙Rh2誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞自噬及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:惡性黑色素瘤的發(fā)病率僅占皮膚癌的5%左右,但其惡性程度高,轉(zhuǎn)移快,且對放療和化療均不敏感,所以預(yù)后極差,治療較為棘手。因此,研制一種提取自天然植物的且具有高敏感性的藥物來治療惡性黑色素瘤是各國學(xué)者努力的主要方向。近年來,提取自天然紅參根部的原人參二醇型低糖鏈皂甙單體-人參皂甙Rh2受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。其抗腫瘤作用已經(jīng)得到眾多國內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)同,但對其抗腫瘤機(jī)制的研究尚未完全研究透徹,如關(guān)于人參皂甙Rh2是否能夠誘導(dǎo)惡性黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生自噬這一研究領(lǐng)域尚未見報道。因此,本文以小鼠惡性黑色素瘤B16細(xì)胞為研究對象,通過檢測自噬標(biāo)志性蛋白-Beclin1和LC3來驗(yàn)證人參皂甙Rh2是否參與誘導(dǎo)惡性黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,同時探討人參皂甙Rh2是否是通過自噬經(jīng)典細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTOR來調(diào)控B16細(xì)胞的自噬。方法:1.采用MTT的方法分別檢測經(jīng)過人參皂甙Rh2干預(yù)24h、48h和72h后,B16細(xì)胞的OD值有何變化,并以此為基礎(chǔ)繪制其細(xì)胞增殖曲線圖,從而分別算取24h、48h和72h三個時間段中,人參皂甙Rh2對B16細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。2.以透射電鏡觀察以人參皂甙Rh2和自噬抑制劑處理B16細(xì)胞后,其生理狀態(tài)是否改變,主要是自噬小體數(shù)量的增減。3.分別提取人參皂甙Rh2干預(yù)前、后B16細(xì)胞的總蛋白,并以Western blot方法檢測其自噬死亡標(biāo)志性蛋白-Beclin1表達(dá)的變化,同時,也檢測經(jīng)人參皂甙Rh2干預(yù)后,B16細(xì)胞的自噬經(jīng)典調(diào)控信號通路PI3K/Akt/mTOR中的主要效應(yīng)分子Akt及mTOR活化水平的變化情況,并用Akt的抑制劑-魚藤素(Deguelin)和mTOR的抑制劑-雷帕霉素(Rapamycin)來反向驗(yàn)證PI3K/Akt/mTOR細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為B16細(xì)胞的自噬調(diào)控機(jī)制之一。4.通過注射接種腫瘤的方式來建立小鼠的黑色素瘤模型,并通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(免疫組化檢測Beclin1和自噬特征蛋白LC3基因的表達(dá))證實(shí)人參皂甙Rh2能夠誘導(dǎo)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬,并且安全較高,副作用低。結(jié)果:1.MTT檢測后,繪制的細(xì)胞增殖曲線結(jié)果表明,人參皂甙Rh2可以抑制B16細(xì)胞生長,且存在濃度和時間依賴性。其中48h的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為59.87±3.75μg/ml。2.經(jīng)過人參皂甙Rh2干預(yù)后的B16細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比,細(xì)胞內(nèi)自噬小體明顯增多。3.Western blot結(jié)果顯示,人參皂甙Rh2干預(yù)后的B16細(xì)胞,自噬死亡標(biāo)志性蛋白Beclin1的表達(dá)較對照組升高明顯,而Akt和mTOR的活性均明顯降低。Akt抑制劑-魚藤素(Deguelin)處理組和魚藤素-人參皂甙組兩組的Beclin1蛋白表達(dá)水平均高于對照組,但單獨(dú)魚藤素組增高程度低于魚藤素+人參皂甙組,而Akt、mTOR活性降低。同樣的,mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)處理組和雷帕霉素-人參皂甙處理組兩組的Beclin1蛋白表達(dá)水平較野生對照組增高,而mTOR活性降低。4.免疫組化結(jié)果證明,經(jīng)人參皂甙Rh2干預(yù)后的小鼠,無論是接種腫瘤前給予藥物,還是注射腫瘤后再給予藥物,其腫瘤組織切片中的Beclin1蛋白與自噬標(biāo)志性蛋白-LC3的表達(dá)水平均明顯高于未經(jīng)人參皂甙Eh2干預(yù)的接種腫瘤的小鼠。5.動物模型血常規(guī)、生化結(jié)果顯示,患有惡性黑色素瘤的小鼠,其白細(xì)胞有小幅上升,而中性粒細(xì)胞百分比上升明顯。相對的,它們的淋巴細(xì)胞百分比、紅細(xì)胞、血紅蛋白以及血小板則明顯下降,且谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶均明顯升高。經(jīng)人參皂甙Rh2干預(yù)后,以上異常情況均得到相對改善。結(jié)論:在人參皂甙Rh2的干預(yù)下,B16細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白LC3和Beclin1明顯升高,因此人參皂甙Rh2可能通過誘導(dǎo)B16細(xì)胞產(chǎn)生自噬而達(dá)到其抑制腫瘤的作用。并且,其有可能是通過P13K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)B16細(xì)胞自噬。
【關(guān)鍵詞】：惡性黑色素瘤 自噬 PI3K/Akt/mTOR 信號通路
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• （一）前言11-13
• （二）材料和方法13-20
• 1. 材料13-16
• 2. 方法16-20
• 3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理20
• （三）結(jié)果20-26
• （四）討論26-29
• （五）結(jié)論29-30
• （六）參考文獻(xiàn)30-32
• 綜述32-40
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 致謝40-41

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本文編號：287081