目的 :研究沉默X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)表達(dá)在焦脫鎂葉綠酸-α甲酯(pyropheophorbide-αmethylester,MPPα)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法(photodynamic therapy,PDT)(MPPα-PDT)處理人骨肉瘤HOS細(xì)胞中的作用,并探討其可能的機(jī)制。方法 :MPPα-PDT作用于HOS細(xì)胞6、12和24h后,用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肌醇依賴酶1α(inositol-requiringenzyme1α,IRE1α)-XBP1通路中相關(guān)蛋白IRE1α和XBP1的表達(dá)水平。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將特異性針對(duì)XBP 1基因的siRNA轉(zhuǎn)入HOS細(xì)胞,然后再行MPPα-PDT處理。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照(negative control,NC)組、siRNAXBP1組、MPPα-PDT組和MPPα-PDT+siRNA-XBP1組,分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中XBP1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平;CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性;FCM法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白剪切型-caspase 3(cleaved-caspase 3)和剪切型-聚ADP-核糖聚合酶(cleaved-poly ADP-ribose polymerase,cleavedPARP)的表達(dá)水平;最后采用DCFH-DA探針染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量以及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)抗氧化相關(guān)蛋白過(guò)氧化氫酶(Catalase)和超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)的表達(dá)水平。結(jié)果:經(jīng)MPPα-PDT誘導(dǎo),HOS細(xì)胞中IRE1α和XBP1蛋白的表達(dá)水平均上調(diào)(P值均0.05)。siRNA-XBP1可抑制HOS細(xì)胞中XBP1mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P值均0.01)。沉默XBP1表達(dá)可降低HOS細(xì)胞的增殖活性(P 0.05),促進(jìn)細(xì)胞凋亡并上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase 3的表達(dá)水平(P 0.05),下調(diào)抗氧化相關(guān)蛋白Catalase和SOD1的表達(dá)水平(P 0.05)。與MPPα-PDT組相比,MPPα-PDT+siRNA-XBP1組細(xì)胞增殖活性降低(P 0.01),凋亡率增高(P 0.05),凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase 3和cleaved-PARP表達(dá)水平增高(P值均0.05),細(xì)胞內(nèi)ROS水平上調(diào)(P 0.01),抗氧化相關(guān)蛋白Catalase和SOD1的表達(dá)水平下調(diào)(P值均0.01)。結(jié)論 :MPPα-PDT可誘導(dǎo)HOS細(xì)胞中IRE1α-XBP1通路激活。沉默XBP1表達(dá)可抑制HOS細(xì)胞的增殖能力并提高其凋亡水平,同時(shí)增強(qiáng)HOS細(xì)胞對(duì)MPPα-PDT的敏感性,其機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及下調(diào)抗氧化分子的表達(dá)水平相關(guān)。
【部分圖文】：

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，與空白對(duì)照組及si RNA-NC組相比，si RNA-XBP1組HOS細(xì)胞的增殖活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（6、12和24 h各時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比，P值均<0.01；與si RNA-NC組相比，P=0.04,P<0.01和P<0.01）；與空白對(duì)照組相比，MPPα-PDT組細(xì)胞增殖活性明顯降低（6、12和24 h時(shí)P值均<0.01）；與MPPα-PDT組相比，MPPα-PDT+si RNA-XBP1組細(xì)胞增殖活性明顯降低（6、12和24 h時(shí)P值均<0.01）；空白對(duì)照組與si RNA-NC組之間的細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（6、12和24 h時(shí)P值均>0.05）。這一結(jié)果提示，siRNA-XBP1可降低HOS細(xì)胞的增殖活性，并且增強(qiáng)MPPα-PDT對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制作用。圖2 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（A）和蛋白質(zhì)印跡法（B）檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-XBP1后人骨肉瘤HOS細(xì)胞中XBP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及聯(lián)合MPPα-PDT處理對(duì)XBP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MPPα-PDT對(duì)人骨肉瘤HOS細(xì)胞中IRE1α和XBP1蛋白表達(dá)水平的影響圖3 CCK-8法檢測(cè)沉默XBP1表達(dá)聯(lián)合MPPα-PDT對(duì)人骨肉瘤HOS細(xì)胞增殖活性的影響

圖2 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（A）和蛋白質(zhì)印跡法（B）檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-XBP1后人骨肉瘤HOS細(xì)胞中XBP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及聯(lián)合MPPα-PDT處理對(duì)XBP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響2.4 沉默XBP1表達(dá)可上調(diào)人骨肉瘤HOS細(xì)胞的凋亡水平
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