背景:尿道下裂是男性常見的先天性外生殖器畸形之一,主要表現(xiàn)為尿道開口異位,即尿道口從遠(yuǎn)端陰莖頭部向近端陰莖根及陰囊移位,常伴隨腹側(cè)包皮缺失和陰莖下彎畸形。其發(fā)病率較高,每200-300個(gè)新生男嬰中可發(fā)生一例,且呈逐年增長趨勢。尿道下裂的唯一治療方法是手術(shù)矯正畸形,但包括尿瘺、尿道狹窄在內(nèi)的術(shù)后并發(fā)癥常無法避免,嚴(yán)重者導(dǎo)致成年后性功能障礙、排尿困難及心理疾病。目前尿道下裂的病因不明,認(rèn)為與環(huán)境、遺傳、激素以及內(nèi)分泌等多種因素共同影響相關(guān),環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是目前研究的熱點(diǎn)。在鄰苯二甲酸鹽類(PEs)中,鄰苯二甲酸二已酯(DEHP)在塑料生產(chǎn)加工中應(yīng)用廣泛,這種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物已經(jīng)證實(shí)能夠誘導(dǎo)雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育異常,但其發(fā)生機(jī)制仍待深入研究。作為發(fā)揮生物功能作用蛋白質(zhì)與遺傳信息載體基因連接的紐帶,轉(zhuǎn)錄組具有快速全面獲取特定組織在特定狀態(tài)下的幾乎所有基因序列及轉(zhuǎn)錄本的優(yōu)點(diǎn),能提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息,廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。雄激素、雄激素受體及相關(guān)信號通路在尿道雄性化過程中發(fā)揮著重要作用,其異常表達(dá)與尿道下裂的發(fā)生相關(guān)。肌腱膜纖維肉瘤基因B型(Mafb)屬于Maf家族,研究表明它不僅在細(xì)胞的增殖、分化及器官的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用,也與雄性泌尿生殖器發(fā)育相關(guān),但作用機(jī)制研究尚不明確。目的:本研究旨在通過對GD16與GD19大鼠胎鼠陰莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,初步篩選正常尿道發(fā)育過程中的一些關(guān)鍵基因和重要的信號傳導(dǎo)通路,進(jìn)一步篩選出與雄激素相關(guān)的差異基因Mafb進(jìn)行驗(yàn)證,探究Mafb及其相關(guān)蛋白在DEHP致大鼠尿道下裂及尿道下裂病人包皮組織中的表達(dá)差異。方法:40只成年SD孕鼠隨機(jī)分成4組(n=10),前兩組予以空白對照處理,分別于妊娠期16d(GD16組)和妊娠期19d(GD19組)剖宮產(chǎn)取出雄性胎鼠,將收集好的胎鼠陰莖組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,lllumina HiSeq 2000篩選出差異表達(dá)基因(DEGs),然后對DEGs進(jìn)行差異基因功能(GO)和pathway顯著富集性分析;選取其中的DEG(Mafb)進(jìn)行免疫熒光驗(yàn)證。后兩組分別予以玉米油(對照組)和DEHP[750mg/(kg.d)](DEHP暴露組)于GD12d至GD19d每日灌胃處理,GD19d剖宮產(chǎn)取出雄性胎鼠,并判斷有無尿道下裂的發(fā)生。掃描電鏡和HE染色觀察陰莖組織形態(tài)學(xué)改變,免疫熒光和western blot檢驗(yàn)陰莖組織中Mafb、β-catenin的表達(dá)水平。同時(shí),收集正常兒童包皮組織,輕度尿道下裂患兒及重度尿道下裂患兒包皮組織各15例,檢測Mafb及其相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:GD19組胎鼠陰莖組織與GD16組胎鼠陰莖組織轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果示1360個(gè)DEGs(其中上調(diào)797個(gè),下調(diào)563個(gè)),差異基因主要富集于細(xì)胞粘著斑信號通路、軸突導(dǎo)向信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體作用信號通路等,選取DEG(Mafb)進(jìn)行免疫熒光驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Mafb的表達(dá)隨發(fā)育顯著增加,與測序結(jié)果相符。而DEHP暴露組胎鼠陰莖組織與對照組胎鼠陰莖組織相比,Mafb、β-catenin表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.05)。尿道下裂包皮組織中Mafb表達(dá)較正常包皮組織顯著下調(diào),而與Mafb相關(guān)蛋白c-Fos表達(dá)顯著增高。結(jié)論:隨著大鼠陰莖組織的正常發(fā)育,Mafb的表達(dá)逐漸增加;而DEHP暴露組較對照組Mafb、β-catenin表達(dá)顯著下調(diào),提示β-cateninMafb信號通路異常表達(dá)可能與DEHP誘發(fā)大鼠尿道下裂發(fā)生相關(guān)。Mafb表達(dá)降低及其相關(guān)蛋白c-fos的上調(diào)可能與人尿道下裂發(fā)生相關(guān)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R726.9
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文17圖1.1差異基因統(tǒng)計(jì)圖及差異基因表達(dá)散點(diǎn)圖Fig.1.1Statisticsandscatterplotofthedifferentiallyexpressedgenes(DEGs).差異基因數(shù)量及散點(diǎn)圖，黃色標(biāo)注的是顯著性上調(diào)基因，藍(lán)色標(biāo)注的是顯著下調(diào)基因。2.2.2差異表達(dá)基因的基因數(shù)量以P值小于0.05且差異倍數(shù)至少兩倍以上為條件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因表達(dá)篩眩結(jié)果如圖1.1所示，在GD16組及GD19組之間共識別有1360個(gè)DEGs，其中上調(diào)差異基因797個(gè)，下調(diào)差異基因563個(gè)。列舉了部分差異基因，如表1.1所示。表1.1部分上調(diào)和下調(diào)差異基因名稱及差異倍數(shù)Table1.1Statisticsofsomeoftheup-regulatedanddown-regulatedgenes(DEGs)IDSymbolDescriptionlog2Ratio(GD19/GD16)P-valueUp-Down*499744Il36ginterleukin36,gamma16.660803738.61E-267Up502143Idi2isopentenyl-diphosphatedeltaisomerase216.40988811.88E-105Up64389Defb4defensinbeta415.958779253.40E-45Up691018Hsd17b14hydroxysteroid(17-beta)dehydrogenase1415.124040511.62E-52Up310575Sprr3smallproline-richprotein315.065079496.95E-47Up60325Serpinb2serpinpeptidaseinhibitor,cladeB(ovalbumin),member214.379919827.40E-78Up

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文192.2.3差異基因顯著性富集分析2.2.3.1差異基因GO富集分析GO功能顯著性富集分析能夠給出同基因組背景比較，顯著富集于差異表達(dá)基因中的GO功能條目，從而找出差異基因表達(dá)同哪些生物學(xué)功能相關(guān)。GO功能條目的獲得主要是基于GO數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋，主要從三個(gè)層面進(jìn)行：生物學(xué)過程（BiologicalProcess,BP）、分子功能（MolecularFunction,MF）和細(xì)胞組分（CellularComponent,CC）。對GD19組與GD16組進(jìn)行DEGsGO富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DEGs功能涉及多方面及多個(gè)信號通路，列舉前20條通路，DEGs顯著富集可見于細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、粘著斑、視黃醇代謝和PPAR信號通路等方面，見圖1.2。圖1.2差異基因的GO功能顯著性富集分析Fig.1.2GOfunctionalclassificationofDEGs2.2.3.2差異基因KEGG富集分析DEGs的Pathway注釋主要是在KEGG數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上完成。使用Fisher法檢

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文20驗(yàn)分析pathway的顯著差異表達(dá)水平，P值小于0.5視為表達(dá)有顯著差異。然后通過富集差異基因的條目，進(jìn)而找出各組間樣品間差異表達(dá)基因同哪些信號通路的改變相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DEGs主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、蛋白質(zhì)消化吸收、粘著斑、視黃醇代謝和PPAR信號通路等方面，見圖1.2。在此基礎(chǔ)上，將顯著差異表達(dá)基因相關(guān)的KEGG通路與GO生物學(xué)過程進(jìn)行繪圖展示。對差異基因數(shù)目超過2的pathway條目，根據(jù)各個(gè)條目對應(yīng)的-log10Pvalue大小從大到小依次篩選排序，繪制出上調(diào)和下調(diào)Top20的KEGG富集分析氣泡圖�？v坐標(biāo)為生物學(xué)過程和通路名稱，縱坐標(biāo)為richfactor，指富集于此pathway條目的基因數(shù)量同所有注釋基因中位于此pathway條目的基因總量的比值。氣泡大小代表DEGs數(shù)量的多少，越大表明所包含的DEGs數(shù)目越多；顏色深淺代表富集的顯著程度，顏色越深代表P值越小，富集越顯著。見圖1.3。圖1.3Pathway富集統(tǒng)計(jì)散點(diǎn)圖Fig.3StatisticsofpathwayenrichmentforGD16-vs-GD19(top20)（縱坐標(biāo)表示生物學(xué)過程和通路名稱，橫坐標(biāo)表示richfactor,氣泡越大代表包含的差異基因數(shù)目越多，顏色越深，其富集P值越小，富集越顯著）
【參考文獻(xiàn)】

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1 曾莉;王玉蕓;張潔;林蘋;龔學(xué)德;黃魯剛;;敵敵畏對大鼠睪丸Leydig細(xì)胞凋亡的影響[J];中華男科學(xué)雜志;2009年11期

本文編號：2866866