目的:鑒定人胰腺癌Panc-1細(xì)胞ezrin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū),利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向敲除ezrin啟動子,檢測啟動子敲除對Panc-1細(xì)胞的ezrin基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法:將攜帶ezrin基因上游片段的報告基因表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞Panc-1,采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng),鑒定ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。使用在線軟件預(yù)測ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的啟動子上下游g RNA靶位點,構(gòu)建基因編輯重組質(zhì)粒p X458-PL和p X459-PR。將重組質(zhì)粒以不同的組合方式共轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞,加入嘌呤霉素初步篩選,針對待敲除序列進(jìn)行基因組DNA的PCR擴(kuò)增和亞克隆測序分析,鑒定Panc-1細(xì)胞ezrin啟動子的靶向敲除。采用RT-q PCR、Western blotting、細(xì)胞增殖和劃痕實驗分別檢測靶向敲除啟動子的胰腺癌細(xì)胞的ezrin基因m RNA和蛋白的表達(dá)情況、細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。結(jié)果:熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,ezrin基因上游–87/+134片段具有轉(zhuǎn)錄激活作用,–1541/–706片段具有轉(zhuǎn)錄激活和增強(qiáng)雙重作用。測序結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了靶向ezrin啟動子的基因編輯重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至Panc-1細(xì)胞,得到ezrin啟動子敲除的胰腺癌細(xì)胞Panc-1-epd。與未轉(zhuǎn)染基因編輯重組質(zhì)粒的對照細(xì)胞Panc-1相比,敲除啟動子的Panc-1-epd細(xì)胞,其ezrin基因m RNA和Ezrin蛋白表達(dá)均顯著下調(diào),細(xì)胞增殖及遷移能力均顯著受到抑制。結(jié)論:靶向敲除ezrin基因啟動子的人胰腺癌細(xì)胞ezrin基因表達(dá)下調(diào),細(xì)胞增殖與遷移能力受到抑制。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R735.9
【部分圖文】：

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文代基強(qiáng)33帶，由此可知質(zhì)粒pX458與pX459已酶切為線性質(zhì)粒。注：M：Marker10000；1：pX458單酶切；2：pX459單酶切圖2質(zhì)粒pX458與pX459單酶切結(jié)果Fig.2SingledigestionresultsofplasmidspX458andpX4592.2.2基因編輯重組質(zhì)粒的構(gòu)建及菌液PCR鑒定將ezrin轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)gRNA靶位點序列對應(yīng)的雜交雙鏈DNA（表1）分別與載體pX458和pX459定向連接，構(gòu)建靶向ezrin啟動子上游、攜帶綠色熒光標(biāo)記的基因編輯重組質(zhì)粒pX458-PL1、pX458-PL2和pX458-PL3，以及靶向ezrin啟動子下游、攜帶嘌呤霉素抗性標(biāo)記的基因編輯重組質(zhì)粒pX459-PR1、pX459-PR2和pX459-PR3，gRNA靶向位點及擬切割位置見圖3，不同組合擬切除片段大小見表17，將6個質(zhì)粒全部共轉(zhuǎn)染時，有15種可能的組合方式，不同組合擬切除片段的位置和大小不同。注：黃色陰影為ezrin啟動子–87/–32序列，下劃線為gRNA靶位點序列，箭頭指示擬切割位點。紅色字體為轉(zhuǎn)錄起始位點+1。

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文代基強(qiáng)35注：M為MarkerDL500；泳道1-4：重組質(zhì)粒pX459-PR1；泳道5-8：重組質(zhì)粒pX459-PR2；泳道9-12：重組質(zhì)粒pX459-PR3圖5基因編輯重組質(zhì)粒pX459-PR菌液PCR結(jié)果Fig.5PCRresultsofrecombinantplasmidpX459-PRgene2.2.3基因編輯重組質(zhì)粒測序驗證基因編輯重組質(zhì)粒測序結(jié)果（圖6）顯示，ezrin啟動子區(qū)gRNA靶位點序列PL和PR分別與載體pX458和pX459定向連接，靶向ezrin啟動子的基因編輯重組質(zhì)粒pX458-PL1、pX458-PL2、pX458-PL3、pX459-PR1、pX459-PR2和pX459-PR3構(gòu)建成功。注：黑色方框分別為PL1、PL2、PL3靶序列；紅色方框分別為PR1、PR2、PR3靶序列圖6ezrin啟動子區(qū)基因編輯重組質(zhì)粒的測序鑒定Fig.6Sequencingandidentificationofezrinpromotergeneeditingrecombinantplasmid2.3基因編輯重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染胰腺癌Panc-1細(xì)胞基因編輯重組質(zhì)粒pX458-PL1/pX459-PR1、pX458-PL2/pX459-PR2、pX458-PL3/pX459-PR3和pX458-PL1/pX458-PL2/pX458-PL3/pX459-PR1/pX459-PR2/pX459-PR3分別共轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，在熒光顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞顯示綠色熒光（圖7），表明攜帶綠色熒光標(biāo)記的質(zhì)粒pX458-PL成功進(jìn)入Panc-1細(xì)胞，推測與之有著相似結(jié)構(gòu)的pX459-PR也能

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文代基強(qiáng)35注：M為MarkerDL500；泳道1-4：重組質(zhì)粒pX459-PR1；泳道5-8：重組質(zhì)粒pX459-PR2；泳道9-12：重組質(zhì)粒pX459-PR3圖5基因編輯重組質(zhì)粒pX459-PR菌液PCR結(jié)果Fig.5PCRresultsofrecombinantplasmidpX459-PRgene2.2.3基因編輯重組質(zhì)粒測序驗證基因編輯重組質(zhì)粒測序結(jié)果（圖6）顯示，ezrin啟動子區(qū)gRNA靶位點序列PL和PR分別與載體pX458和pX459定向連接，靶向ezrin啟動子的基因編輯重組質(zhì)粒pX458-PL1、pX458-PL2、pX458-PL3、pX459-PR1、pX459-PR2和pX459-PR3構(gòu)建成功。注：黑色方框分別為PL1、PL2、PL3靶序列；紅色方框分別為PR1、PR2、PR3靶序列圖6ezrin啟動子區(qū)基因編輯重組質(zhì)粒的測序鑒定Fig.6Sequencingandidentificationofezrinpromotergeneeditingrecombinantplasmid2.3基因編輯重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染胰腺癌Panc-1細(xì)胞基因編輯重組質(zhì)粒pX458-PL1/pX459-PR1、pX458-PL2/pX459-PR2、pX458-PL3/pX459-PR3和pX458-PL1/pX458-PL2/pX458-PL3/pX459-PR1/pX459-PR2/pX459-PR3分別共轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，在熒光顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞顯示綠色熒光（圖7），表明攜帶綠色熒光標(biāo)記的質(zhì)粒pX458-PL成功進(jìn)入Panc-1細(xì)胞，推測與之有著相似結(jié)構(gòu)的pX459-PR也能
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2864384