發(fā)布時(shí)間：2017-03-30 16:11

  本文關(guān)鍵詞：低劑量3,3’-二吲哚甲烷通過(guò)調(diào)控Wnt4自分泌促進(jìn)胃癌進(jìn)展，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:3,3’-二吲哚甲烷(DIM)對(duì)癌癥的治療作用已被證實(shí),但不同劑量的DIM對(duì)胃癌是否有不同作用尚不清楚,本研究旨在探討低劑量的抗腫瘤藥物DIM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及腫瘤干細(xì)胞特性的影響及作用機(jī)制,為揭示低劑量DIM在胃癌中的作用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù),同時(shí)也為DIM更好的應(yīng)用臨床提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法。方法:應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響,采用Western blot和免疫熒光檢測(cè)低劑量的DIM作用胃癌細(xì)胞后增殖、遷移和干性相關(guān)蛋白及信號(hào)通路蛋白表達(dá)的變化情況。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分析低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞成脂分化潛能的影響。聯(lián)合β-catenin通路抑制劑ICG001預(yù)處理,通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Western blot和成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證低劑量的DIM是否通過(guò)活化β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和增強(qiáng)其干性及分化潛能。采用TOP/FOP Flash熒光蟲(chóng)素酶報(bào)告基因檢測(cè)低劑量的DIM對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化情況。構(gòu)建和包裝PORCN、WNT4以及GFP對(duì)照慢病毒shRNA,并轉(zhuǎn)染和篩選HGC-27穩(wěn)定細(xì)胞株。運(yùn)用q RT-PCR和Western blot檢測(cè)PORCN、WNT4的敲減效率,通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Western blot、免疫熒光和成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)低劑量的DIM對(duì)PORCN、WNT4敲減后的HGC-27細(xì)胞增殖、遷移、干性及分化潛能的影響。采用裸鼠皮下致瘤模型研究低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力的影響,qRT-PCR檢測(cè)瘤組織中Snail和N-cadherin的表達(dá),免疫組化和免疫熒光檢測(cè)瘤組織中Wnt4、β-catenin和CD44的表達(dá)。結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高劑量的DIM顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖,而低劑量的DIM能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖蛋白PCNA和Cyclin-D3的表達(dá)、遷移相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin的上調(diào)和E-cadherin的下調(diào),增強(qiáng)其干性蛋白CD44、Sall4、Oct4、Cmyc和Sox2的表達(dá)。研究顯示低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和干性的促進(jìn)作用與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化有關(guān),且該作用可被β-catenin抑制劑ICG001所逆轉(zhuǎn);干擾WNT分子自分泌后,DIM的這種作用即可逆轉(zhuǎn),證明低劑量的DIM可能通過(guò)促進(jìn)WNT分子自分泌促進(jìn)胃癌干性及進(jìn)展;篩檢HGC-27細(xì)胞中WNT分子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)WNT4明顯上調(diào),將其敲減后,低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞的促增殖、促遷移、干性上調(diào)作用明顯減弱。裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)表明,低劑量的DIM預(yù)處理的胃癌細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力明顯增強(qiáng)。免疫組化、免疫熒光結(jié)果顯示低劑量DIM作用組瘤組織中Wnt4、β-catenin和CD44表達(dá)都明顯增強(qiáng)。結(jié)論:低劑量的DIM通過(guò)誘導(dǎo)Wnt4自分泌途徑活化β-catnin信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移并增強(qiáng)其干性,促進(jìn)體內(nèi)胃癌的發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 3 3’-二吲哚甲烷 自分泌 Wnt4 β-catenin
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 英文縮略詞中英文注釋表15-17
• 第一章 緒論17-23
• 1.1 胃癌17-18
• 1.1.1 EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移17
• 1.1.2 腫瘤干性與腫瘤形成17-18
• 1.2 3,3′-diindolylmethane（DIM）與胃癌18-20
• 1.2.1 DIM生物學(xué)特性18-19
• 1.2.2 DIM的抗腫瘤作用及機(jī)制19
• 1.2.3 低劑量的DIM對(duì)腫瘤的作用及機(jī)制19-20
• 1.2.4 小分子藥物與細(xì)胞再編程20
• 1.3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路與胃癌20-23
• 1.3.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路20-21
• 1.3.2 PORCN基因：Wnts分子脂質(zhì)修飾的關(guān)鍵21
• 1.3.3 Wnt/β-catenin與EMT和腫瘤干性21
• 1.3.4 Wnt/β-catenin與胃癌21-23
• 第二章 研究目的、方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和意義23-27
• 2.1 研究目的23
• 2.2 研究方法23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案24-26
• 2.4 研究意義26-27
• 第三章 低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及干性調(diào)節(jié)的影響27-40
• 3.1 材料27-29
• 3.1.1 細(xì)胞株27
• 3.1.2 主要試劑27-28
• 3.1.3 主要儀器及相關(guān)耗材28-29
• 3.2 方法29-32
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)29
• 3.2.2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)29
• 3.2.3 細(xì)胞蛋白的提取29
• 3.2.4 Western blot29-30
• 3.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)30
• 3.2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)30-31
• 3.2.7 細(xì)胞免疫熒光31
• 3.2.8 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)31
• 3.2.9 統(tǒng)計(jì)分析31-32
• 3.3 結(jié)果32-38
• 3.3.1 低劑量的DIM促進(jìn)胃癌細(xì)胞克隆集落形成32-33
• 3.3.2 低劑量的DIM上調(diào)胃癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)33-34
• 3.3.3 低劑量的DIM促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移34-35
• 3.3.4 低劑量的DIM促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT的發(fā)生35-36
• 3.3.5 低劑量的DIM增強(qiáng)胃癌細(xì)胞干性和分化能力36-38
• 3.4 討論38-40
• 第四章 低劑量的DIM通過(guò)活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)胃癌進(jìn)展40-48
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 細(xì)胞株40
• 4.1.2 主要試劑40
• 4.1.3 主要儀器及相關(guān)耗材40-41
• 4.2 方法41-42
• 4.2.1 細(xì)胞蛋白的提取和Western blot41
• 4.2.2 細(xì)胞免疫熒光41
• 4.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)41
• 4.2.4 成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)41
• 4.2.5 上清的收集41-42
• 4.2.6 熒光蟲(chóng)素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)42
• 4.2.7 上清作用細(xì)胞42
• 4.3 結(jié)果42-46
• 4.3.1 低劑量的DIM活化 β-catenin42-43
• 4.3.2 β-catenin通路抑制劑ICG001可以逆轉(zhuǎn)低劑量的DIM對(duì)胃癌細(xì)胞的影響43-45
• 4.3.3 低劑量的DIM活化Wnt/β-catenin信號(hào)通路45-46
• 4.4 討論46-48
• 第五章 低劑量的DIM通過(guò)促進(jìn)HGC-27細(xì)胞Wnt4的自分泌活化 β-catenin信號(hào)通路48-63
• 5.1 材料48-50
• 5.1.1 細(xì)胞株48
• 5.1.2 主要試劑48-50
• 5.1.3 主要儀器及相關(guān)耗材50
• 5.2 方法50-54
• 5.2.1 質(zhì)粒制備50-51
• 5.2.2 包裝病毒51-52
• 5.2.3 慢病毒感染HGC-27細(xì)胞52
• 5.2.4 細(xì)胞總RNA提取52-53
• 5.2.5 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)53
• 5.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR53
• 5.2.7 Western blot53
• 5.2.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)53
• 5.2.9 細(xì)胞免疫熒光53
• 5.2.10 成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)53-54
• 5.3 結(jié)果54-61
• 5.3.1 HGC-27細(xì)胞PORCN的干擾效果確證54-55
• 5.3.2 低劑量的DIM通過(guò)誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞Wnt自分泌來(lái)活化 β-catenin促進(jìn)胃癌進(jìn)展55-57
• 5.3.3 篩檢低劑量DIM誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的Wnts分子57
• 5.3.4 低劑量的DIM增強(qiáng)HGC-27細(xì)胞Wnt4的表達(dá)57-58
• 5.3.5 HGC-27細(xì)胞WNT4的干擾效果確證58-59
• 5.3.6 WNT4干擾對(duì)HGC-27細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響59-60
• 5.3.7 低劑量的DIM通過(guò)增強(qiáng)HGC-27細(xì)胞Wnt4自分泌活化 β-catenin促進(jìn)胃癌進(jìn)展60-61
• 5.4 討論61-63
• 第六章 低濃度的DIM促進(jìn)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤63-71
• 6.1 材料63-65
• 6.1.1 細(xì)胞株63
• 6.1.2 主要試劑63-64
• 6.1.3 主要儀器及相關(guān)耗材64
• 6.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物64-65
• 6.2 方法65-66
• 6.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)65
• 6.2.2 裸鼠皮下荷瘤模型65
• 6.2.3 組織RNA提取65
• 6.2.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)65
• 6.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR65
• 6.2.6 腫瘤組織病理分析65
• 6.2.7 免疫組織化學(xué)65-66
• 6.2.8 組織免疫熒光66
• 6.2.9 統(tǒng)計(jì)分析66
• 6.3 結(jié)果66-70
• 6.3.1 低劑量的DIM促進(jìn)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)66-67
• 6.3.2 低劑量的DIM促進(jìn)裸鼠瘤組織Snail和N-cadherin的表達(dá)67-68
• 6.3.3 低劑量的DIM在體內(nèi)促進(jìn)瘤組織Wnt4、β-catenin和CD44的表達(dá)68-70
• 6.4 討論70-71
• 第七章 結(jié)論與展望71-73
• 7.1 結(jié)論71-72
• 7.2 展望72-73
• 參考文獻(xiàn)73-82
• 致謝82-84
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的科研成果及參加的學(xué)術(shù)會(huì)議84-85

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本文編號(hào)：277531