本文關(guān)鍵詞：ANXA11沉默影響慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞惡性行為及分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一種造血干細(xì)胞異常克隆的惡性腫瘤,大約占所有癌癥的0.3%,占成人白血病的20%,95%的CML病例呈BCR-ABL陽性。BCR-ABL融合基因由9號(hào)和22號(hào)染色體易位形成,編碼原癌蛋白BCR-ABL,該蛋白具持續(xù)激活的酪氨酸激酶活性,BCR-ABL酪氨酸激酶可激活下游信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)增殖、增強(qiáng)細(xì)胞遷移、干擾細(xì)胞正常凋亡、阻斷細(xì)胞分化,最終引發(fā)CML。ANXA11(Annexin A11,膜聯(lián)蛋白A11)為膜聯(lián)蛋白家族一員,是Ca2+依賴性膜結(jié)合蛋白,廣泛表達(dá)于除酵母以外的真核細(xì)胞中。研究表明ANXA11表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤惡性轉(zhuǎn)變、耐藥性及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),但與白血病的關(guān)系鮮有報(bào)道。目的:1、構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞,篩選得到ANXA11表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的K562單克隆細(xì)胞株;2、研究ANXA11下調(diào)對K562細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;3、探究ANXA11調(diào)控K562細(xì)胞生物行為相關(guān)分子機(jī)制。方法:1、根據(jù)人源ANXA11的mRNA序列,設(shè)計(jì)針對其特異的shRNA及無關(guān)序列作為陰性對照,并構(gòu)建到p GPU6/GFP/Neo表達(dá)載體中;2、利用Lipofetamin 2000轉(zhuǎn)染試劑,將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞,G418篩選及有限稀釋法得到相應(yīng)單克隆細(xì)胞株,采用qPCR和Western blot方法檢測穩(wěn)定下調(diào)表達(dá)ANXA11的K562單克隆細(xì)胞株;3、倒置顯微鏡觀察ANXA11沉默對K562細(xì)胞形態(tài)的影響;4、CCK-8檢測ANXA11沉默對K562細(xì)胞體外增殖能力的影響;5、甲基纖維素集落實(shí)驗(yàn)檢測ANXA11沉默對K562細(xì)胞體外克隆形成能力的影響;6、Transwell檢測ANXA11沉默對K562細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的影響;7、qPCR、Western blot分析ANXA11下調(diào)對K562細(xì)胞中相關(guān)分子表達(dá)的影響。結(jié)果:1、篩選得到穩(wěn)定下調(diào)表達(dá)ANXA11的K562單克隆細(xì)胞株(K562-shANXA11)及無關(guān)序列單克隆細(xì)胞株(K562-shNC)。與K562-shNC細(xì)胞相比,K562-shANXA11中ANXA11在mRNA和蛋白水平分別下調(diào)了94%和95%;2、K562-shANXA11較K562-shNC細(xì)胞增殖明顯受到抑制;3、K562-shANXA11較K562-shNC細(xì)胞克隆形成數(shù)下降了45%;4、K562-shANXA11較K562-shNC細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)分別減少了36%和43%;5、K562-shANXA11較K562-shNC細(xì)胞形態(tài)變大,且K562-shANXA11細(xì)胞中巨核細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD61表達(dá)明顯上調(diào)(2.27倍);6、ANXA11沉默抑制了STAT5b、Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-6、FAK、MMP-2的表達(dá)及STAT5和FAK磷酸化;ANXA11沉默上調(diào)了MEK1/2、ERK2磷酸化及Elk1和TIMP-1的表達(dá)。結(jié)論:1、成功獲得穩(wěn)定下調(diào)表達(dá)ANXA11的K562單克隆細(xì)胞株K562-shANXA11;2、ANXA11沉默明顯抑制K562細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力;3、ANXA11沉默誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化;4、ANXA11沉默可通過抑制STAT5相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控K562細(xì)胞增殖、克隆形成;ANXA11沉默可通過抑制FAK相關(guān)的信號(hào)通路調(diào)控K562細(xì)胞遷移、侵襲。另外,ANXA11沉默可能通過激活MEK/ERK2/ElK1通路誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化。
【關(guān)鍵詞】：膜聯(lián)蛋白 A11 K562 細(xì)胞 FAK STAT5 MEK/ERK2
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.72
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 前言13-14
• 第一部分 ANXA11表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的K562細(xì)胞株的建立14-30
• 材料和方法14-21
• 1.材料14-16
• 1.1 細(xì)胞株14
• 1.2 引物和載體14
• 1.3 主要儀器及試劑14-16
• 2.方法16-20
• 2.1 載體構(gòu)建及驗(yàn)證16-17
• 2.2 ANXA11表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的K562細(xì)胞的建立17-20
• 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析20-21
• 結(jié)果21-25
• 1.表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證21-22
• 2. pGPU6/GFP/Neo真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞22-23
• 3. qPCR檢測單克隆細(xì)胞ANXA11 mRNA水平23-24
• 4. Western blot檢測單克隆細(xì)胞株ANXA11蛋白水平24-25
• 討論25-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-30
• 第二部分 ANXA11沉默對K562細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移侵襲、分化及相關(guān)信號(hào)分子的影響30-49
• 材料和方法30-35
• 1.材料30-32
• 1.1 細(xì)胞系30
• 1.2 主要儀器及試劑30-32
• 2.方法32-35
• 2.1 ANXA11沉默對K562細(xì)胞增殖能力的影響32
• 2.2 ANXA11沉默對K562細(xì)胞克隆形成能力的影響32
• 2.3 ANXA11 沉默對 K562 細(xì)胞遷移能力的影響32-33
• 2.4 ANXA11 沉默對 K562 細(xì)胞侵襲能力的影響33
• 2.5 ANXA11 沉默對 K562 細(xì)胞分化的影響33-34
• 2.6 q PCR檢測相關(guān)分子34
• 2.7 Western blot 檢測相關(guān)分子34-35
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析35
• 結(jié)果35-42
• 1. ANXA11沉默抑制K562細(xì)胞體外增殖能力35-36
• 2. ANXA11 沉默抑制 K562 細(xì)胞克隆形成能力36-37
• 3. ANXA11沉默抑制K562細(xì)胞體外遷移能力37-38
• 4. ANXA11沉默抑制K562細(xì)胞體外侵襲能力38-39
• 5. ANXA11沉默誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化39
• 6. ANXA11沉默抑制STAT5b表達(dá)及STAT5活性39-40
• 7. ANXA11 沉默抑制抗凋亡蛋白表達(dá)40
• 8. ANXA11沉默影響遷移、侵襲相關(guān)分子的表達(dá)40-41
• 9. ANXA11 沉默增強(qiáng) MEK/ERK2/El K1 信號(hào)活性41-42
• 討論42-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述49-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61-62

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  本文關(guān)鍵詞：ANXA11沉默影響慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞惡性行為及分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：264827