本文關(guān)鍵詞：ASIC1a在缺血性腦白質(zhì)損傷中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腦白質(zhì)損傷與短時(shí)和長時(shí)的記憶、記憶力處理速度、執(zhí)行能力降低有關(guān),并且是輕度認(rèn)知障礙轉(zhuǎn)化為癡呆的危險(xiǎn)因素。腦血管病變和因腦血管病變引起的低灌注是腦白質(zhì)病變的主要原因。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),腦白質(zhì)損傷主要病理表現(xiàn)為髓鞘減少、與髓鞘和軸突損失有關(guān)的組織稀疏、以及輕微的神經(jīng)膠質(zhì)增多。髓鞘主要是由少突膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成,對(duì)軸突起到營養(yǎng)和保護(hù)的作用。因此,防止少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷和丟失可以作為治療腦白質(zhì)損傷的一條重要途徑。缺血性腦白質(zhì)損傷相關(guān)機(jī)制仍然不是很清楚。腦缺血后組織由于能量代謝障礙等原因?qū)е滤嵝援a(chǎn)物堆積,引起腦組織酸化,從而激活酸敏感的陽離子通道ASIC1a。那么,ASIC1a是否參與到缺血性腦白質(zhì)的損傷過程呢?目前有關(guān)的研究甚少。為此,本實(shí)驗(yàn)擬通過大鼠缺血性腦白質(zhì)損傷模型探討ASIC1a在其中的變化、可能的機(jī)制和作用。為臨床治療缺血性腦白質(zhì)病變提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分ASIC1a在腦白質(zhì)中時(shí)空表達(dá)情況的研究目的:觀察體內(nèi)、體外ASIC1a在腦白質(zhì)的時(shí)空表達(dá)情況。方法:在體內(nèi)通過免疫組化雙標(biāo)的方法檢測(cè)OPC標(biāo)記物NG2、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CNPase和APC與ASIC1a共標(biāo)情況;在體外同樣通過免疫組化雙標(biāo)的方法檢測(cè)OPC標(biāo)記物A2B5、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CNPase與ASIC1a共標(biāo)情況。結(jié)果:在體內(nèi)胼胝體部位的NG2陽性細(xì)胞、CNPase陽性細(xì)胞、APC陽性細(xì)胞上可見ASIC1a的表達(dá);在體外,A2B5陽性細(xì)胞、CNPase陽性細(xì)胞與ASIC1a可以雙標(biāo)。結(jié)論:ASIC1a在體內(nèi)、體外腦白質(zhì)中的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系均有表達(dá)。第二部分ASIC1a在缺血性腦白質(zhì)損傷中的作用目的:探討ASIC1a在缺血性腦白質(zhì)損傷中的作用。方法:采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎制作缺血性腦白質(zhì)損傷(WML)大鼠模型,腹腔注射不同劑量ASIC1a通道的抑制劑阿米洛利(2、10mg/kg/d),連續(xù)30 d。隨機(jī)分為正常組(normal)、WML模型對(duì)照組(control)、2mg/kg/d阿米洛利處理組(AMI2)、10mg/kg/d阿米洛利處理組(AMI10),每組5只。采用Luxol Fast Blue(LFB)染色法檢測(cè)胼胝體髓鞘的形態(tài);電鏡觀察胼胝體部髓鞘軸突直徑、髓鞘厚度和G-ratio;免疫組織化學(xué)染色觀察APC陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量;Western blot法檢測(cè)MBP、CNPase、caspase-3和ASIC1a的表達(dá)變化;體外酸化環(huán)境誘導(dǎo)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPC)損傷,觀察其對(duì)OPC分化的影響。結(jié)果:1)LFB染色顯示,與正常組相比,對(duì)照組胼胝體軸突損傷明顯,髓鞘變稀疏,LFB染色變淺,光密度值顯著降低(P0.05,vs.normal);與對(duì)照組比較,AMI2、AMI10組髓鞘變得較密,LFB染色明顯加深,光密度值顯著升高(P0.05,vs.control)。2)電鏡檢測(cè)胼胝體部位髓鞘軸突直徑、髓鞘厚度和G-ratio。與正常組相比,對(duì)照組髓鞘軸突直徑、髓鞘厚度變短,脫髓鞘現(xiàn)象明顯;與對(duì)照組相比,AMI2、AMI10組髓鞘軸突直徑、髓鞘厚度增加,同時(shí)G-ratio明顯降低。3)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與正常組相比,胼胝體部位APC陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少;與對(duì)照組相比,AMI2、AMI10組APC陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加。4)Western blot顯示,與正常組相比,在對(duì)照組MBP、CNPase和ASIC1a的表達(dá)顯著降低(P0.05,vs.normal);caspase3的表達(dá)增加(P0.05,vs.normal)。與對(duì)照組相比,AMI2和AMI10組MBP、CNPase和ASIC1a表達(dá)增加(P0.05,vs.control);caspase3的表達(dá)下降(P0.05,vs.control)。5)體外酸化環(huán)境對(duì)OPC分化的影響:p H6.0酸化環(huán)境誘導(dǎo)OPC損傷,OPC分化為CNPase陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少,與p H7.0生理?xiàng)l件下相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,vs.p H7.0)。在酸化環(huán)境條件下,阿米洛利抑制組,CNPase陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多,與p H6.0酸環(huán)境相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,vs.pH6.0)。結(jié)論:阿米洛利抑制ASIC1a通道可以改善缺血性腦白質(zhì)損傷,具有髓鞘保護(hù)的作用。第三部分ASIC1a對(duì)缺血性腦白質(zhì)損傷大鼠認(rèn)知功能的作用目的:探討ASIC1a對(duì)缺血性腦白質(zhì)損傷大鼠認(rèn)知功能影響。方法:采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎制作缺血性腦白質(zhì)損傷(WML)大鼠模型,腹腔注射不同劑量ASIC1a通道的抑制劑阿米洛利(2、10mg/kg/d),連續(xù)30 d。隨機(jī)分為正常組(normal)、WML模型對(duì)照組(control)、2mg/kg/d阿米洛利處理組(AMI2)、10mg/kg/d阿米洛利處理組(AMI10),每組5只。通過Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變,記錄各組大鼠的逃避潛伏期的時(shí)間、逃避潛伏期的軌跡。結(jié)果:在4天的定位航行訓(xùn)練中,與正常組的逃避潛伏期時(shí)間(10.74±1.469s)相比,對(duì)照組逃避潛伏期時(shí)間(29.13±3.535s)明顯延長(p0.05,vs.normal);與對(duì)照組相比,AMI2逃避潛伏期時(shí)間(22.16±1.978s),有差異但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05,vs.control),AMI10處理組逃避潛伏期時(shí)間(18.79±1.195s)明顯縮短,其中以最后一天結(jié)果最顯著,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05,vs.control)。結(jié)論:阿米洛利通過抑制ASIC1a通道可以改善缺血性腦白質(zhì)損傷大鼠認(rèn)知功能。
【關(guān)鍵詞】：缺血性腦白質(zhì)損傷 少突膠質(zhì)細(xì)胞 ASIC1a ASIC1a抑制劑阿米洛利
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-23
• 1 缺血性腦白質(zhì)損傷現(xiàn)狀17
• 2 腦白質(zhì)損壞的病理機(jī)制17-19
• 3 ASICs和ASIC1a19-20
• 4 細(xì)胞外酸性pH值能夠抑制少突膠質(zhì)前體細(xì)胞生存、遷移和分化20-21
• 5 ASIC1a與髓鞘保護(hù)作用21-23
• 第一部分 ASIC1a在腦白質(zhì)中的時(shí)空表達(dá)的研究23-40
• 1 材料23-28
• 1.1 主要試劑23-24
• 1.2 儀器24-25
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物25
• 1.4 試劑配制方法25-28
• 2 方法28-34
• 2.1 B-104細(xì)胞的培養(yǎng)方法28-29
• 2.2 OPC的原代培養(yǎng)方法29-31
• 2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)31
• 2.4 神經(jīng)元原代培養(yǎng)31-32
• 2.5 腦組織灌注和切片32-33
• 2.6 細(xì)胞免疫組化33-34
• 2.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì)34
• 3 結(jié)果34-38
• 3.1 ASIC1a在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)34-36
• 3.2 ASIC1a在少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系表達(dá)36-38
• 4 討論38-40
• 第二部分 ASIC1a在缺血性腦白質(zhì)損傷中作用的研究40-55
• 1 材料40-43
• 1.1 主要試劑40-41
• 1.2 試劑配方41-43
• 1.3 儀器43
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物43
• 2 方法43-48
• 2.1 分組與給藥43-44
• 2.2 缺血性腦白質(zhì)損傷模型（CCAO）的建立44
• 2.3 腦組織切片的制備44
• 2.4 Luxol Fast Blue染色44
• 2.5 超微結(jié)構(gòu)電鏡標(biāo)本取材44-45
• 2.6 腦組織蛋白樣品的制備45
• 2.7 蛋白濃度測(cè)定45-46
• 2.8 Western Blot46-47
• 2.9 體外培養(yǎng)原代少突膠質(zhì)前體細(xì)胞酸中毒誘導(dǎo)細(xì)胞損傷測(cè)定47-48
• 2.10 結(jié)果統(tǒng)計(jì)48
• 3 結(jié)果48-52
• 3.1 Luxol Fast Blue髓鞘染色48-49
• 3.2 胼胝體部髓鞘電鏡下超微結(jié)構(gòu)49-50
• 3.3 免疫組織化學(xué)50
• 3.4 Western Blot50-51
• 3.5 體外酸環(huán)境對(duì)OPC分化的影響51-52
• 4 討論52-55
• 第三部分 ASIC1a對(duì)缺血性腦白質(zhì)損傷中大鼠認(rèn)知功能的作用55-59
• 1 材料55
• 1.1 試劑55
• 1.2 主要儀器55
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物55
• 1.4 試劑配制方法55
• 2 方法55-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)分組55
• 2.2 WML模型構(gòu)建55
• 2.3 WML模型大鼠的藥物處理55
• 2.4 Morris水迷宮試驗(yàn)55-56
• 2.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)56
• 3 結(jié)果56-57
• 4 討論57-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-69
• 個(gè)人簡歷和研究成果69-71
• 致謝71

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