【摘要】：目的:胸苷激酶1(thymidine kinase 1,TK1)是細(xì)胞增殖標(biāo)記物,可用于腫瘤患者的早期篩查、治療監(jiān)測、預(yù)后判斷等。在近十年里,多個(gè)實(shí)驗(yàn)室制備了不同的抗TK1抗體用于腫瘤疾病的檢測和預(yù)后,但靈敏度較低,不能滿足臨床需要。本研究主要目的為研制可用于臨床的TK1抗體,建立化學(xué)發(fā)光檢測方法,為不同類型腫瘤的研究及臨床應(yīng)用提供物質(zhì)和技術(shù)支撐。方法:1.合成目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、Xho I/Eco RI雙酶切、與表達(dá)載體p ET32a連接、轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞,制備BL21-p ET32a-TK1重組菌,并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。2.采用IPTG誘導(dǎo)BL21-p ET32a-TK1重組菌表達(dá)TK1蛋白,并從IPTG作用濃度、培養(yǎng)溫度和時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,用鎳離子親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物,獲得TK1重組蛋白,通過SDS-PAGE檢測目的蛋白純度,western blot檢測目的蛋白抗原性。3.用上述獲得的TK1重組蛋白免疫小鼠,選用免疫效果最好的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,篩選出能穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆細(xì)胞株。通過小鼠腹腔誘生法制備單抗,用正辛酸-硫酸銨沉淀和親和層析純化腹水,并對(duì)純化后的單克隆抗體進(jìn)行純度、亞型及特異性鑒定。4.篩選配對(duì)抗體,確定最佳反應(yīng)體系,以及該檢測方法的線性范圍,并進(jìn)行功能性檢測,初步建立化學(xué)發(fā)光檢測方法。結(jié)果:1.獲得BL21-p ET32a-TK1重組菌。2.在37℃條件下,IPTG濃度為0.2 m M,誘導(dǎo)6 h時(shí)重組蛋白TK1表達(dá)量最高且為可溶性表達(dá)。鎳離子親和層析梯度洗脫在80 m M咪唑條件下TK1重組蛋白純度最大,經(jīng)western blot檢測蛋白具有抗原性。3.通過ELISA間接法,篩選出8株Ig G1亞型、且特異性高的抗TK1單克隆細(xì)胞株,并制備8株單克隆抗體,經(jīng)SDS-PAGE檢測所得抗體純度均大于95%。4.獲得1對(duì)可用于TK1化學(xué)發(fā)光檢測方法的配對(duì)抗體:包被抗體4G3和酶標(biāo)抗體5E3。經(jīng)優(yōu)化包被及酶標(biāo)條件,最佳檢測體系為:4G3每孔包被200 ng,酶標(biāo)抗體5E3 1:2000稀釋。利用此檢測條件,檢測線性范圍可達(dá)到100-5000pg/m L。結(jié)論:利用基因工程技術(shù),雜交瘤技術(shù)制備出8株TK1單克隆抗體,并篩選出一對(duì)配對(duì)抗體,應(yīng)用該配對(duì)抗體,初步建立TK1化學(xué)發(fā)光檢測方法。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.43

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本文編號(hào)：2610153