發(fā)布時(shí)間：2019-09-26 00:53

【摘要】：接觸性皮炎(Contact dermatitis)是一種遲發(fā)型超敏反應(yīng)疾病。此類疾病是抗原誘導(dǎo)的一種T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng),是效應(yīng)T細(xì)胞與特異性抗原結(jié)合作用引起的以單核細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)。此類炎癥反應(yīng)發(fā)生較慢,通常在接觸相同抗原后24-72小時(shí)出現(xiàn),因此又被稱為遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。此類反應(yīng)的發(fā)生與抗體無(wú)關(guān),只與效應(yīng)T細(xì)胞和吞噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子或細(xì)胞毒性介質(zhì)有關(guān)。玉屏風(fēng)散是一副中藥名劑,由黃芪、防風(fēng)和白術(shù)三個(gè)單味藥構(gòu)成,有記載的使用歷史已有千年之久,目前臨床主要用于治療過(guò)敏性鼻炎、上呼吸道反復(fù)感染等過(guò)敏性疾病。首先,使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法,通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索構(gòu)建與接觸性皮炎、超敏反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)模型;通過(guò)反向分子對(duì)接構(gòu)建構(gòu)建玉屏風(fēng)散中有效成分可能作用的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。整合上述兩個(gè)網(wǎng)絡(luò),獲得了 23個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白,這些蛋白可能是玉屏風(fēng)散改善接觸性皮炎分子機(jī)制中的靶點(diǎn)蛋白,分別為 HSP90AA1、ESR1、CDK2、ELANE、F2、PPP1CC、LCK、PCK1、NR3C1、PGR、CCNA2、SRC、BTK、ABL1、CASP1、DPP4、JAK2、KIT、PRKCQ、GRB2、PYGL、HPGDS。在20個(gè)用于反向分子對(duì)接的小分子化合物中,有13個(gè)化合物預(yù)測(cè)到Y(jié)PFS可以通過(guò)Hsp90改善接觸性皮炎反應(yīng),提示Hsp90可能是玉屏風(fēng)散改善接觸性皮炎的重要靶點(diǎn)。熱休克蛋白90(Hsp90)是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的一類高度保守的分子伴侶蛋白,通過(guò)維持其客戶蛋白的穩(wěn)定與活性而間接調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。將上述得到的23個(gè)蛋白再與數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索的得到的Hsp90客戶蛋白進(jìn)行交集,發(fā)現(xiàn)其中其中有6個(gè)蛋白是Hsp90的客戶蛋白,分別是SRC、CDK2、LCK、PRKCQ、CCNA2和NR3C1。提示Hsp90不僅可以自己作為潛在靶點(diǎn)影響下游信號(hào)通路改善接觸性皮炎,同時(shí)也可以作為分子伴侶影響其他潛在靶點(diǎn)活性來(lái)改善接觸性皮炎。本文選用玉屏風(fēng)散各單味藥的有效成分及其組合物來(lái)治療2'4-二硝基氟苯(DNFB)致Balb/C小鼠CD模型,使用ELISA、qPCR和流式細(xì)胞術(shù)在分子和細(xì)胞水平上檢測(cè)細(xì)胞因子含量的變化以及耳組織切片病理狀況變化來(lái)評(píng)價(jià)各有效成分的治療效果。并且使用免疫印記來(lái)檢測(cè)Hsp90、Akt蛋白量的變化以及對(duì)下游NF-κB(p65)入核活化的影響進(jìn)一步研究玉屏風(fēng)散抑制炎癥反應(yīng)的機(jī)制。ELISA結(jié)果表明玉屏風(fēng)散有效成分可以改善模型鼠血清IFN-γ上升;qPCR結(jié)果表明,玉屏風(fēng)散有效成分可以改善模型鼠脾臟組織中IFN-γ、IL-2和TNF-α的mRNA水平。免疫印記顯示出,黃芪甲苷和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可以顯著降低Hsp90和Akt含量,進(jìn)而抑制了 NF-κB的活化。并且結(jié)果顯示出黃芪甲苷和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ相對(duì)于升麻素苷和5-O甲基維斯阿米醇苷有更好的抗炎作用。這說(shuō)明Hsp90可能是玉屏風(fēng)散改善接觸性皮炎的靶點(diǎn)。LPS刺激巨噬細(xì)胞可以引起Hsp90蛋白量上升,并且活化NF-κB信號(hào)通路。同時(shí),LPS刺激可以引起COX-2表達(dá)上調(diào),引起下游前列腺素含量上升,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。我們用玉屏風(fēng)散中的四個(gè)有效小分子化合物預(yù)孵Raw264.7細(xì)胞1.5h后使用LPS刺激,24h后檢測(cè)培養(yǎng)基中TNF-α和NO含量,進(jìn)一步觀察玉屏風(fēng)散有效成分的抑制炎癥作用,然后再使用免疫印記檢測(cè)Hsp90和Akt蛋白量以及NF-κB信號(hào)通路的活化情況。結(jié)果顯示四種有效成分都有一定的抑制炎癥作用,培養(yǎng)基中TNF-α和 NO含量較于陰性對(duì)照均有下降,其中黃芪甲苷和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ給藥組的改善作用比較明顯。免疫印記結(jié)果表現(xiàn)出黃芪甲苷和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可以明顯減少Hsp90和Akt的蛋白量,從而抑制NF-κB活化,改善炎癥反應(yīng)。綜上所述,Hsp90可能是玉屏風(fēng)散改善接觸性皮炎的靶點(diǎn),并且通過(guò)影響其客戶蛋白Akt的穩(wěn)定來(lái)抑制下游NF-κB信號(hào)通路的活化改善炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2541722