【摘要】：抑郁癥是一種常見的、具有較嚴(yán)重危害的、易復(fù)發(fā)的精神類疾病,且隨抑郁癥病情加重患者可出現(xiàn)自殺傾向。目前,抑郁癥的發(fā)病機理仍不十分清楚,安全有效臨床治療抑郁藥物相對匱乏。因此,探索抑郁癥病理機制與發(fā)現(xiàn)新的抗抑郁藥物至關(guān)重要。抑郁癥患者常伴隨著中樞神經(jīng)炎癥的發(fā)生。抑郁癥患者尸檢結(jié)果顯示其腦皮層、海馬等功能區(qū)小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)活化狀態(tài),星形膠質(zhì)細胞數(shù)量和密度減少并伴隨功能失調(diào),這些觀察結(jié)果可顯示抑郁癥末期機體生理病理指標(biāo),但可能不能很好地解釋抑郁癥患者初期中樞神經(jīng)炎癥產(chǎn)生與機體免疫炎癥變化。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,星形膠質(zhì)細胞也可產(chǎn)生并分泌神經(jīng)炎性細胞因子與趨化因子,可調(diào)節(jié)中樞免疫,如星形膠質(zhì)細胞活化加重了阿爾茲海默癥中樞神經(jīng)炎癥,但其在抑郁癥中樞神經(jīng)炎癥中扮演的角色亟需探索。慢性應(yīng)激是誘發(fā)抑郁癥的重要因素之一,它可激活神經(jīng)-內(nèi)分泌中樞下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸),導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素持續(xù)升高。本課題組前期工作已觀察到慢性不可預(yù)見溫和應(yīng)激(CUMS)刺激大鼠12周后,腦功能區(qū)前額葉皮層炎性細胞因子IL-1β蛋白成熟、神經(jīng)炎癥發(fā)生以及星形膠質(zhì)細胞標(biāo)記蛋白GFAP表達降低等。為進一步探索星形膠質(zhì)細胞在慢性應(yīng)激刺激初期可能引起的免疫調(diào)節(jié)變化,本文選用應(yīng)激水平的糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)酮)體外處理星形膠質(zhì)細胞,以模擬抑郁癥初期星形膠質(zhì)細胞狀態(tài),探索星形膠質(zhì)細胞是否發(fā)生以IL-1β成熟為特征的免疫炎性改變及其可能存在的機制,在此基礎(chǔ)上,分析中藥成分是否可具有調(diào)控作用,以期發(fā)現(xiàn)其抗抑郁可能的作用途徑。正常人血清皮質(zhì)醇濃度在137-283 nM范圍內(nèi)。文獻報道應(yīng)激狀態(tài)下大鼠海馬游離皮質(zhì)酮水平27ng/mL(約80nM)。因此,本文選用終濃度100nM皮質(zhì)酮處理原代分離并純化培養(yǎng)SD大鼠星形膠質(zhì)細胞,24、48和72 h后檢測細胞內(nèi)白細胞介素1β(IL-1β)基因和蛋白的變化。與正常組比較,IL-1β基因與總蛋白水平未產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)顯著性變化,但IL-1β成熟體表達水平顯著增加(p0.05)。進一步檢測胞內(nèi)NOD樣受體蛋白3(NLRP3)和蛋白半胱天冬酶-1(Caspase-1)表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞在100 nM皮質(zhì)酮處理后NLRP3(p0.01)和成熟體Caspase-1(p0.001)蛋白水平顯著升高,提示應(yīng)激水平皮質(zhì)酮可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞發(fā)生以NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)IL-1β成熟為特征的免疫炎性改變。本課題組前期工作證實,硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(TXNIP)參與誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活以及IL-1β蛋白成熟。在本文研究中觀察到原代培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細胞經(jīng)皮質(zhì)酮處理72h后,細胞內(nèi)TXNIP蛋白顯著升高(p0.001)。TXNIP作為細胞內(nèi)硫氧還蛋白(TRX)內(nèi)源性抑制因子,可通過調(diào)節(jié)TRX活性影響TRX系統(tǒng)對細胞內(nèi)活性氧的清除。細胞內(nèi)過表達TXNIP可通過抑制硫氧還蛋白-1(TRX-1)活性,促進細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)累積以激活NLRP3炎癥小體和IL-1β蛋白剪切成熟。本文也檢測到100 nM皮質(zhì)酮所處理72 h的原代星形膠質(zhì)細胞內(nèi)TRX-1蛋白水平顯著降低(p0.001)與ROS水平顯著升高(p0.001)。有研究證實TXNIP表達可能受糖皮質(zhì)激素轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響。因此,本文對100nM皮質(zhì)酮處理的原代SD大鼠星形膠質(zhì)細胞TXTVIP基因表達進行檢測,發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)酮處理72 h后,細胞內(nèi)TXNIP基因表達顯著性升高(p0.001),約為正常組表達水平的2倍。這些研究結(jié)果提示應(yīng)激水平皮質(zhì)酮可通過上調(diào)原代大鼠星形膠質(zhì)細胞TXNIP基因與蛋白水平、下調(diào)TRX-1蛋白水平,促使細胞內(nèi)ROS累積,引起了以NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)IL-1β蛋白剪切成熟的免疫炎性改變。另外,本文在小鼠C8-D1A星形膠質(zhì)細胞上進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),100 nM皮質(zhì)酮處理小鼠C8-D1A細胞72 h后,細胞內(nèi)IL-1β基因與總蛋白水平也未顯著性變化,其成熟體蛋白水平顯著增加(p0.001),NLRP3(p0.01)與成熟體Caspase-1(p0.001)蛋白水平也顯著性升高。另外,該模型細胞內(nèi)TXNIP基因和蛋白表達水平顯著增加(p0.01、p0.001),但TRX-1蛋白水平顯著降低(p0.01),同時活性氧水平顯著增加(p0.001)與SD大鼠原代星形膠質(zhì)細胞上觀察到的結(jié)果相一致。這些研究結(jié)果提示應(yīng)激水平皮質(zhì)酮同樣可通過上調(diào)小鼠C8-D1A細胞TXNIP基因和蛋白表達、下調(diào)TRX-1蛋白水平,促使細胞內(nèi)ROS累積,引起以NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)IL-1β蛋白剪切成熟為特征的免疫炎性改變。本文使用C57BL/6小鼠進行在體研究,皮質(zhì)酮(20mg/kg)皮下注射連續(xù)三周,鹽酸氟西汀(10mg/kg)以灌胃方式,連續(xù)給藥三周。使用Western blot方法檢測到皮質(zhì)酮模型小鼠皮層星形膠質(zhì)細胞TXNIP蛋白過表達(p0.001)、TRX-1蛋白低表達(p0.01),NLRP3與成熟體Caspase-1蛋白高表達(p0.001),以及IL-1β蛋白剪切成熟(p0.01),以及這些效應(yīng)被氟西汀所逆轉(zhuǎn),具體表現(xiàn)在降低模型動物皮層星形膠質(zhì)細胞TXNIP(p0.001),上調(diào)TRX-1(p0.001),抑制NLRP3炎癥小體激活與IL-1β蛋白成熟(p0.01)。由于星形膠質(zhì)細胞的活化可以促使細胞免疫炎性因子的成熟釋放,在皮質(zhì)酮模型小鼠上已經(jīng)觀察到皮層星形膠質(zhì)細胞標(biāo)記蛋白GFAP表達降低,同時也發(fā)現(xiàn)100 nM皮質(zhì)酮處理72 h后,原代培養(yǎng)SD大鼠星形膠質(zhì)細胞內(nèi)GFAP蛋白過表達,提示該模型下原代大鼠星形膠質(zhì)細胞處于活化狀態(tài)。一般認(rèn)為,星形膠質(zhì)細胞可通過糖酵解途徑將所攝取的葡萄糖代謝為乳酸,并將其分泌到胞外為神經(jīng)元提供能量,而TXNIP蛋白對細胞葡萄糖攝取起到了負(fù)調(diào)控作用,但在應(yīng)激水平下細胞內(nèi)糖酵解功能是否受到影響?因此,本文初步研究了皮質(zhì)酮對原代大鼠星形膠質(zhì)細胞糖酵解產(chǎn)物胞外乳酸水平以及糖酵解關(guān)鍵酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)基因表達的影響,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)100nM皮質(zhì)酮處理72 h可顯著降低原代大鼠星形膠質(zhì)細胞胞外乳酸水平(p0.01)以及胞內(nèi)糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3基因表達水平(p0.01)。這些實驗結(jié)果表明應(yīng)激水平皮質(zhì)酮可以引起原代星形膠質(zhì)細胞胞外乳酸分泌降低及糖酵解關(guān)鍵酶基因下調(diào)。提示應(yīng)激水平皮質(zhì)酮可能使原代星形膠質(zhì)細胞激活并促進細胞糖酵解代謝失衡。淫羊藿黃酮類成分、二苯乙烯類成分和姜黃素等均具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等功能。但這些中藥成分能否逆轉(zhuǎn)應(yīng)激水平皮質(zhì)酮所誘導(dǎo)的原代大鼠星形膠質(zhì)細胞——IL-1β成熟增加仍不可知。為篩選可抑制皮質(zhì)酮所引起星形膠質(zhì)細胞免疫炎性的有效中藥活性成分,本文在上述應(yīng)激水平皮質(zhì)酮所誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活和IL-1β成熟為特征的免疫炎性改變細胞星形膠質(zhì)模型上,分析白藜蘆醇、紫檀，

本文編號：2537281