【摘要】：本論文研究工作為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目—"當(dāng)歸-紅花配伍養(yǎng)血活血量效關(guān)系與協(xié)同增效相互作用研究"和"江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目"的部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。論文共分為四章,第一章綜述了藥對和新生化顆粒的研究進(jìn)展。第二章到第四章為實(shí)驗(yàn)部分,其具體的研究內(nèi)容和相應(yīng)結(jié)論如下:第二章基于當(dāng)歸系列藥對的新生化顆粒配伍效應(yīng)研究第一節(jié)基于當(dāng)歸系列藥對的新生化顆粒的養(yǎng)血作用配伍效應(yīng)研究采用撤藥分析法比較評價(jià)當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中的養(yǎng)活作用貢獻(xiàn),養(yǎng)血指標(biāo)主要包括外周血常規(guī)參數(shù)、臟器指數(shù)、Na+-K+和Ca2+-Mg2+ATP酶活性。采用環(huán)磷酰胺和乙酰苯肼聯(lián)合復(fù)制血虛小鼠模型;與正常組小鼠相比,模型組小鼠的外周血常規(guī)、臟器指數(shù)和ATP酶活性均有顯著性差異(P0.01),表明血虛模型復(fù)制成功。給予新生化顆粒(XSHG)及新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對樣品后(DY、DC、DT、DH、DJ和DZ)后,各給藥組小鼠的各相關(guān)養(yǎng)血效應(yīng)的指標(biāo)均有不同程度的改善。進(jìn)一步將各給藥組的藥效數(shù)據(jù)經(jīng)過主成分分析(PCA),采用各給藥組到空白組的相對距離法來比較當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中的養(yǎng)血作用。各給藥組的養(yǎng)血作用的大小順序?yàn)?XHSGDJDTDZDHDCDY。結(jié)合多指標(biāo)綜合指數(shù)法的分析數(shù)據(jù),表明當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中藥學(xué)效應(yīng)方面皆有作用,當(dāng)歸-益母草和當(dāng)歸-川芎藥對在方中的養(yǎng)血貢獻(xiàn)程度最大。該方法為新生化顆粒的臨床合理應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù),并為復(fù)雜方劑的配伍研究提供了方法的參考。第二節(jié)基于當(dāng)歸系列藥對的新生化顆粒的活血作用配伍效應(yīng)研究比較評價(jià)新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)和凝血功能的影響,探討當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻(xiàn)。采用冰水浴和皮下注射鹽酸腎上腺素共同復(fù)制急性血瘀大鼠模型。根據(jù)全血黏度(WBV)、血漿黏度(PV)、血沉(ESR)和紅細(xì)胞壓積(HCT)等指標(biāo),觀察新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響;以血小板最大聚集率(ADP)、凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血漿纖維蛋白原含量(FIB),觀察新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對前后對血瘀大鼠的血小板聚集和凝血功能的影響。采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法和主成分分析法綜合評價(jià)當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻(xiàn)。研究結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組的各血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);與模型組比較,新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對前后對急性血瘀大鼠的血液流變學(xué)和凝血功能的多個(gè)指標(biāo)皆有一定的改善作用。多指標(biāo)綜合指數(shù)法和主成分分析法綜合評價(jià)得出,新生化顆粒對血瘀大鼠的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于拆方組和生化湯組;新生化顆粒缺失當(dāng)歸系列藥對后,各給藥組的活血效應(yīng)均有一定程度的降低;缺失不同的當(dāng)歸藥對后對原方的活血效應(yīng)影響不同,當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻(xiàn)的順序?yàn)?當(dāng)歸-益母草當(dāng)歸-川芎當(dāng)歸-紅花當(dāng)歸-炙甘草當(dāng)歸-桃仁當(dāng)歸-姜炭。該研究表明,當(dāng)歸系列藥對是新生化顆粒的重要組成部分,不同的當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中的活血作用貢獻(xiàn)不同;且當(dāng)歸-益母草藥對在全方中的活血作用貢獻(xiàn)最大,與新生化顆粒的組方結(jié)構(gòu)(重用益母草)以及益母草"活血行滯、祛瘀生新"的功效相一致,與前期當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中的養(yǎng)血血效應(yīng)貢獻(xiàn)度一致。第三章新生化顆粒體內(nèi)外效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究第一節(jié)新生化顆粒配伍前后的主要效應(yīng)成分含量變化研究新生化顆粒來源于經(jīng)典名方生化湯,臨床上常用來治療產(chǎn)后疾病。它的效應(yīng)成分主要包括:芳香酸類、苯酞類、生物堿類、黃酮類和姜辣素類成分。為比較新生化顆粒七個(gè)單味藥配伍前后效應(yīng)成分的含量變化,本文首次建立了超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法(UHPLC-TQ/MS)同時(shí)測定新生化顆粒及其單味藥中27個(gè)效應(yīng)成分的含量。在優(yōu)化的色譜條件下,27 個(gè)效應(yīng)成分在 20 min 內(nèi)于 Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm × 3 mm,1.9μm)色譜柱上得到了較好的分離。結(jié)果顯示:除了胸腺嘧啶、對香豆酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯H和藁本內(nèi)酯外,其它有效成分的含量配伍后均顯著性增加;不同類型化合物配伍前后的變化率的順序?yàn)?姜辣素類黃酮類芳香酸類生物堿類苯酞類。該方法為新生化顆粒的質(zhì)量控制提供了參考,同時(shí)也有助于闡明新生化顆粒的藥物相互作用規(guī)律。第二節(jié)當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究綜合前期的活血、養(yǎng)血作用貢獻(xiàn)的效應(yīng)整合結(jié)果,皆表明藥對當(dāng)歸-益母草和當(dāng)歸-川芎在方中的貢獻(xiàn)程度大�；诖�,從各拆方樣品中效應(yīng)成分的含量變化方面揭示當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒中不同貢獻(xiàn)的潛在原因。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(UHPLC-TQ-MS/MS)法比較評價(jià)新生化顆粒及其拆方樣品中有效成分的含量變化。結(jié)果表明,與新生化顆粒組相比,大部分效應(yīng)成分在其拆方樣品中皆有不同程度的降低;在樣品DY中,除了甘草素外,其它效應(yīng)成分較新生化顆粒中相應(yīng)的成分均有不同程度的降低。進(jìn)一步將各樣品中效應(yīng)成分的含量做標(biāo)化后做PCA分析,其中,DY和DC樣品組距XSHG組最遠(yuǎn),從化學(xué)成分含量角度表明了藥對當(dāng)歸-益母草和當(dāng)歸-川芎在新生化顆粒的貢獻(xiàn)程度較大的原因。該方法為闡明當(dāng)歸系列藥對在新生化顆粒的配伍規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。第三節(jié)新生化顆粒在正常和血虛模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究建立新生化顆粒中15個(gè)效應(yīng)成分在大鼠血漿中的UPLC-MS/MS的測定方法,比較評價(jià)主要效應(yīng)成分在正常和血虛模型大鼠灌胃給藥新生化顆粒后的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的行為差異。新生化顆粒在正常和血虛模型大鼠的灌胃劑量均為9.72 g·kg-1。15個(gè)效應(yīng)成分在血漿中的線性關(guān)系良好(r ≥ 0.9925),所有分析物的日間和日內(nèi)精密度分別小于10.88%和11.87%,相應(yīng)的準(zhǔn)確度相對誤差在±12.38%范圍內(nèi)。除了甘草酸以及甘草次酸,新生化顆粒中其它效應(yīng)成分在正常和血虛模型大鼠中Tmax和t1/2均較短,在6小時(shí)內(nèi)基本消除完全;較空白組相比,模型組中除了苦杏仁苷、甘草苷和甘草次酸,其它效應(yīng)成分的藥動(dòng)學(xué)行為均有明顯的差異;整體而言,各類效應(yīng)成分在模型大鼠中的AUC0-t、AUC0-∞均明顯高于正常大鼠(P0.05),Tmax均有不同程度的提前。表明在血虛病理狀態(tài)下,通過激活血虛大鼠體內(nèi)的代謝酶的活力,使得效應(yīng)成分的代謝速率和程度被改變。其中,以水蘇堿和益母草堿為代表的生物堿類,在體內(nèi)較長時(shí)間保持較高的血藥濃度,提示生物堿類成分可能是新生化顆粒發(fā)揮養(yǎng)血效應(yīng)的重要活性成分,其養(yǎng)血作用機(jī)理需要進(jìn)一步研究。第四章基于代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的新生化顆粒養(yǎng)血作用機(jī)制研究第一節(jié)基于代謝組學(xué)的新生化顆粒的養(yǎng)血作用機(jī)制研究采用大鼠眼底靜脈叢放血法復(fù)制大鼠失血性血虛模型,共分為失血性模型組、正常組、新生化顆粒組、生化湯組、當(dāng)歸-益母草組,當(dāng)歸組和益母草組。應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF/MS)技術(shù),對各組大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物進(jìn)行分析,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)對血漿中內(nèi)源性標(biāo)記物進(jìn)行多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,并基于SPSS19.0對潛在差異性標(biāo)記物進(jìn)行P檢驗(yàn)。結(jié)果顯示,PCA中血虛大鼠與其他各組能夠達(dá)到基本分離;進(jìn)一步對潛在的差異性標(biāo)記物定性鑒定,共鑒定出18個(gè)差異性標(biāo)記物。與正常組相比,模型組中8-異前列腺素F2a、神經(jīng)鞘氨醇、溶血卵磷脂LysOPC(20:4)、磷酸泛酰半胱氨酸、15-脫氧-d-12,14-前列腺素J2、脫氧膽酸、脫氧核糖胸腺苷酸、9-反式-視黃酸、亮氨酸-苯丙氨酸、L-胱硫醚、泛醌-2、鞘氨醇1-磷酸、S-腺苷高半胱氨酸、16-羥基孕烯醇酮和4-氧化-視黃酸的含量顯著增加(P0.01);模型組中16-去氫黃體酮、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的含量明顯降低(P0.05)。在各給藥組的大鼠體內(nèi),這些差異性內(nèi)源性物質(zhì)得到了不同程度的恢復(fù)。采用Matlab構(gòu)建血虛相關(guān)通路分析,失血性血虛模型主要泛酸和輔酶A的生物合成、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、鞘脂類代謝有關(guān)。不同給藥組可以調(diào)節(jié)以上紊亂的3條代謝通路向正常轉(zhuǎn)歸,其藥效學(xué)和內(nèi)源性標(biāo)記物的代謝軌跡的結(jié)果均顯示,不同給藥組對失血模型大鼠的改善程度為:XSHGSHDDYDGYMC。第二節(jié)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的新生化顆粒的養(yǎng)血作用靶點(diǎn)預(yù)測采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對新生化顆粒中58個(gè)潛在效應(yīng)成分的養(yǎng)血分子作用機(jī)制進(jìn)行分析,探討其多成分、多靶點(diǎn)、多通路的相關(guān)關(guān)系。依據(jù)PharmMapper、SEA、STITCH、Drugbank等數(shù)據(jù)庫和文本挖掘的方法構(gòu)建了與46個(gè)血虛相關(guān)的靶蛋白;然后將獲得靶蛋白導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫建立血虛相關(guān)作用通路;最后,采用Cytoscape軟件建立新生化顆粒成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型。養(yǎng)血效應(yīng)方面,新生化顆粒中58個(gè)效應(yīng)成分涉及46個(gè)作用蛋白和24條作用通路;24條作用通路主要涉及血虛過程中的紅細(xì)胞功能、免疫功能、能量代謝、炎癥因子和血管微循環(huán);其中,預(yù)測到的24條血虛代謝通路與前期的代謝組學(xué)有7條吻合。文獻(xiàn)研究和本課題組的代謝組學(xué)研究結(jié)果均證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的可靠性。該結(jié)果體現(xiàn)了新生化顆粒的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用模式,為深入研究新生化顆粒的養(yǎng)血的分子作用機(jī)制提供參考。第三節(jié)新生化顆粒養(yǎng)血效應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)驗(yàn)證課題組前期采用代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對新生化顆粒的養(yǎng)血機(jī)制進(jìn)行了探索性研究。研究結(jié)果均表明,產(chǎn)后血虛證主要和能量代謝紊亂、血液微循環(huán)障礙、紅細(xì)胞合成降低、炎癥爆發(fā)以及免疫功能降低有關(guān)�；谝陨系姆治鼋Y(jié)果,本節(jié)對新生化顆粒潛在養(yǎng)血代謝通路上的關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行了生物活性驗(yàn)證。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),新生化顆粒通過提高機(jī)體的EPOR、F2、TNF-α、IL-6、ACSS1、COASY、AHCY 和 CBS 的表達(dá),降低體內(nèi) S1PR1、SPHK1和HIF-1α的含量,繼而改善血虛狀態(tài)下的能量代謝紊亂、血液微循環(huán)障礙和增強(qiáng)紅細(xì)胞功能而發(fā)揮養(yǎng)血作用。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
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本文編號：2534306