本文關(guān)鍵詞：分化過程中Pkm2的表達(dá)特征及指示Pkm2表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng)的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《大連醫(yī)科大學(xué)》 2015年

分化過程中Pkm2的表達(dá)特征及指示Pkm2表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng)的建立

仉立強(qiáng)  

【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、探究基因Pk(Pyruvate Kinase)在小鼠胚胎干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及小鼠各個(gè)組織器官的表達(dá)情況,驗(yàn)證M2型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase Subtype M2,Pkm2)在小鼠胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中高表達(dá)。2、探究ES細(xì)胞中及重編程過程中癌基因Pkm2,與Pkm2表達(dá)調(diào)控相關(guān)的部分基因的表達(dá)情況。探究分化過程中與分化相關(guān)的三個(gè)胚層基因的表達(dá)變化,Pkm2,Pkm1,多能性基因Nanog,Oct4及與Pkm2表達(dá)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)變化,進(jìn)一步驗(yàn)證干細(xì)胞與Pkm2的相互關(guān)系。3、胚胎干細(xì)胞中能夠指示Pkm2表達(dá)的紅色熒光報(bào)告系統(tǒng)的建立。4、利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)及能夠指示Pkm2表達(dá)的紅色熒光報(bào)告系統(tǒng),篩選出對Pkm2的表達(dá)起調(diào)控作用的新基因、新蛋白,并進(jìn)一步研究該基因及蛋白與Pkm2的相互作用及在重編程過程中的功能。實(shí)驗(yàn)方法:第一,得到由C57BL/6小鼠制備的小鼠成纖維細(xì)胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEF),來源于129系小鼠的胚胎干細(xì)胞R1及由MEF誘導(dǎo)來的多能干細(xì)胞Li PS-37,然后分別提取C57BL/6小鼠的各個(gè)組織、器官,通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法,檢測這些小鼠特定的組織、器官及MEF、R1、Li PS-37等細(xì)胞系中Pk三個(gè)同工酶(Pkm1、Pkm2、Pklr)的表達(dá)情況。同時(shí),檢測ES及重編程過程中Pkm2及與Pkm2表達(dá)調(diào)控相關(guān)的基因的表達(dá)情況,另外在小鼠胚胎干細(xì)胞R1中進(jìn)行維甲酸(Retinoic Acid,RA)、去除白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)和除去飼養(yǎng)細(xì)胞(Feeder Cell)或者是促進(jìn)擬胚體(Embryoid Body,EB)的形成等處理,使得R1分化,觀察在分化過程中基因Pkm1和Pkm2,多能性基因Nanog和Oct4,與胚胎發(fā)育相關(guān)的三個(gè)胚層的基因Pax6、Foxa2、Gata6的表達(dá)變化,以及與Pkm2調(diào)控相關(guān)的部分基因的表達(dá)變化。第二,借助于CRISPR/Cas9系統(tǒng)及同源重組的方法,根據(jù)小鼠胚胎干細(xì)胞染色體癌基因Pkm2的基因序列設(shè)計(jì)sg RNA及兩個(gè)特定的同源臂,將能夠編碼紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)的基因克隆到兩個(gè)特定的同源臂之間,構(gòu)建指示癌基因Pkm2紅色熒光蛋白表達(dá)的載體,然后將這種載體瞬轉(zhuǎn)到小鼠胚胎干細(xì)胞R1細(xì)胞系中,Cas9復(fù)合體能夠通過向?qū)蛄?guide sequence)與DNA靶位點(diǎn)結(jié)合,在sg RNA存在的情況下,RFP會特異性的并插入到小鼠胚胎干細(xì)胞染色體Pkm2基因的特定位置,可以用來指示Pkm2在小鼠胚胎干細(xì)胞R1細(xì)胞系的表達(dá)情況,并且將得到的該細(xì)胞系進(jìn)行分化處理,直接觀察紅色熒光的亮度變化。第三,利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組的方法,在該指示Pkm2表達(dá)的紅色熒光細(xì)胞系中篩選出能夠?qū)τ诩t色熒光有影響的新基因、新蛋白,并進(jìn)一步研究新基因、新蛋白與Pkm2的相互關(guān)系及在重編程過程中的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(一)癌基因Pkm2的特異性表達(dá)及在分化、重編程過程中發(fā)揮著重要作用癌基因Pkm2特異性在小鼠胚胎干細(xì)胞R1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞Li PS-37中表達(dá)量較高,并且Pkm2在重編程過程中表達(dá)逐漸增高,在分化過程中表達(dá)逐漸降低。(二)建立紅色熒光蛋白指示Pkm2表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng)及陽性細(xì)胞系的純化及擴(kuò)增建系運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)及同源重組的方法,將sg RNA及同源臂導(dǎo)入到癌基因Pkm2表達(dá)量較高的胚胎干細(xì)胞R1中,我們可以看到有紅色熒光表達(dá)的陽性細(xì)胞,對這些陽性的細(xì)胞進(jìn)行挑單克隆及擴(kuò)增建系,最終得到了純化的含有紅色熒光表達(dá)的R1細(xì)胞系。(三)利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)篩選的方法篩選對Pkm2表達(dá)調(diào)控起作用的新基因、新蛋白我們首先在293T細(xì)胞中驗(yàn)證了該轉(zhuǎn)座現(xiàn)象,為進(jìn)一步在ES細(xì)胞及i PS細(xì)胞中篩選對Pkm2的表達(dá)起作用的新基因、新蛋白打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2;Q78
【目錄】：

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