【摘要】：一、研究意義控制中藥材中黃曲霉毒素污染是解決中藥材安全問(wèn)題的核心,亟待解決。近些年,人們對(duì)中藥材的需求量日益攀升,但中藥材中黃曲霉毒素污染問(wèn)題日益突出,將有可能對(duì)使用者的生命健康造成威脅。產(chǎn)毒黃曲霉菌屬于曲霉屬(Aspergillus)的一類多細(xì)胞微生物,廣泛存在于空氣、水、土壤等自然環(huán)境中,空氣、水及昆蟲(chóng)等都能成為其傳播途徑,是中藥材的主要污染菌。中藥材被產(chǎn)毒黃曲霉菌污染后,產(chǎn)毒黃曲霉菌在適宜條件下將會(huì)大量繁殖并且產(chǎn)生黃曲霉毒素,而黃曲霉毒素產(chǎn)生后很難消除。因此,中藥材中產(chǎn)毒黃曲霉菌的"預(yù)警監(jiān)測(cè)"是從源頭控制黃曲霉毒素污染及交叉污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)被世界衛(wèi)生組織劃定為I類致癌物,對(duì)人及動(dòng)物肝臟組織具有嚴(yán)重的破壞作用,可造成肝癌、慢性肝炎、黃疽肝炎、肝腫大以及肝硬化,其中黃曲霉毒素B1毒性和致癌性最強(qiáng)也最為多見(jiàn)。近年來(lái)隨著中藥材應(yīng)用量的攀增,研究人員在陳皮、杏仁、黃芪、地龍等多種中藥材中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉菌污染超標(biāo)的現(xiàn)象,將有可能對(duì)使用安全造成嚴(yán)重威脅。因此,黃曲霉毒素污染是影響中藥飲用安全的重要問(wèn)題,亟待解決。二、國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展傳統(tǒng)的產(chǎn)毒真菌分類鑒別一般采用形態(tài)學(xué)方法,但其要求鑒定者有較強(qiáng)的專業(yè)知識(shí),并且存在鑒別準(zhǔn)確率低、用時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn),且鑒定者需較強(qiáng)的專業(yè)知識(shí)。而分子檢測(cè)方法因其高度準(zhǔn)確性,耗時(shí)短且客觀性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),在產(chǎn)毒真菌的種類檢測(cè)和鑒定方面得到了深入的研究和廣泛的應(yīng)用。目前已報(bào)道的產(chǎn)毒黃曲霉菌分子檢測(cè)方法包括D NA直接測(cè)序、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)、多重PCR、熒光定量PC R等。但是,上述檢測(cè)方法均耗時(shí)較長(zhǎng),一般需要2小時(shí)以上,其中DNA測(cè)序則需更長(zhǎng)時(shí)間,無(wú)法滿足當(dāng)前大樣本快速定性定量檢測(cè)的要求。因此,針對(duì)目前產(chǎn)毒黃曲霉菌的檢測(cè),亟需一種更快速準(zhǔn)確的定性定量方法。目前,廣泛應(yīng)用的黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)主要包括儀器分析方法和免疫學(xué)分析方法。儀器分析方法主要涉及薄層法、液相色譜法、氣相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用等,免疫學(xué)分析方法主要有酶聯(lián)免疫分析和側(cè)流層析檢測(cè)技術(shù)及其產(chǎn)品。然而,儀器分析方法需要復(fù)雜的樣本前處理,昂貴的儀器和具有大量專業(yè)知識(shí)的技術(shù)人員,無(wú)法同時(shí)檢測(cè)大量樣本。免疫分析方法雖然檢測(cè)時(shí)間有所縮短,但仍然在2小時(shí)以上,且檢測(cè)成本也較高。因此,亟需一種更快速、高效且成本低的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于黃曲霉毒素的檢測(cè)。三、研究目標(biāo)1、建立"環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)"快速檢測(cè)中藥材中產(chǎn)毒黃曲霉菌。2、建立"熒光偏振免疫分析技術(shù)"快速定性定量檢測(cè)中藥材中黃曲霉毒素B1。3、同步高通量定性定量檢測(cè)中藥材中產(chǎn)毒黃曲霉菌及黃曲霉毒素。四、研究?jī)?nèi)容與結(jié)果1、黃曲霉菌和中藥材中其他真菌的培養(yǎng)與鑒定。利用黃曲霉菌選擇培養(yǎng)基對(duì)中藥材中的黃曲霉菌進(jìn)行選擇性培養(yǎng),結(jié)合ITS條形碼及形態(tài)鑒定方法系統(tǒng)鑒定為黃曲霉菌(Asperqillus flavus)。本研究通過(guò)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)中藥材中其他真菌,結(jié)合IT S條形碼及形態(tài)鑒定方法進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。2、建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。本研究根據(jù)功能基因VER-1的外顯子序列設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系的擴(kuò)增引物,并優(yōu)化體系獲得穩(wěn)定高效的擴(kuò)增結(jié)果,在此基礎(chǔ)上結(jié)合實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù),成功建立了黃曲霉菌的實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。3、建立了熒光定量PCR檢測(cè)方法。本研究通過(guò)對(duì)黃曲霉毒素生物合成關(guān)鍵基因設(shè)計(jì)特異引物,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)黃曲霉菌進(jìn)行定性定量檢測(cè)。4、建立了熒光偏振免疫分析檢測(cè)方法。本研究運(yùn)用化學(xué)合成的方法,將黃曲霉毒素與氨基熒光素結(jié)合,得到能與黃曲霉毒素抗體結(jié)合且具有熒光信號(hào)的熒光標(biāo)記物,并通過(guò)薄層色譜和質(zhì)譜對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行確定。由于黃曲霉毒素和黃曲霉毒素?zé)晒鈽?biāo)記物與黃曲霉毒素抗體的結(jié)合存在相互競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,并且與抗體結(jié)合前后分子量和旋轉(zhuǎn)速度會(huì)發(fā)生變化,從而引起熒光偏振數(shù)值的變化。本研究根據(jù)該原理測(cè)得熒光偏振數(shù)值建立線性回歸曲線,實(shí)現(xiàn)對(duì)黃曲霉毒素的定性定量檢測(cè)。5、建立了 HPLC檢測(cè)方法。本研究通過(guò)對(duì)黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化得到熒光信號(hào)更強(qiáng)更穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物,并利用高效液相方法通過(guò)熒光檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行定性定量分析。6、完成四個(gè)不同環(huán)節(jié)的六味代表性中藥材的72份樣品的收集和對(duì)中藥材樣品中黃曲霉菌和黃曲霉毒素的檢測(cè)。對(duì)采集得到的六味代表性中藥材共72份樣品,采用實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)黃曲霉菌含量,采用熒光偏振和高效液相技術(shù)檢測(cè)黃曲霉菌毒素的含量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2420495