【摘要】：一、研究意義控制中藥材中黃曲霉毒素污染是解決中藥材安全問題的核心,亟待解決。近些年,人們對中藥材的需求量日益攀升,但中藥材中黃曲霉毒素污染問題日益突出,將有可能對使用者的生命健康造成威脅。產(chǎn)毒黃曲霉菌屬于曲霉屬(Aspergillus)的一類多細(xì)胞微生物,廣泛存在于空氣、水、土壤等自然環(huán)境中,空氣、水及昆蟲等都能成為其傳播途徑,是中藥材的主要污染菌。中藥材被產(chǎn)毒黃曲霉菌污染后,產(chǎn)毒黃曲霉菌在適宜條件下將會大量繁殖并且產(chǎn)生黃曲霉毒素,而黃曲霉毒素產(chǎn)生后很難消除。因此,中藥材中產(chǎn)毒黃曲霉菌的"預(yù)警監(jiān)測"是從源頭控制黃曲霉毒素污染及交叉污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)被世界衛(wèi)生組織劃定為I類致癌物,對人及動物肝臟組織具有嚴(yán)重的破壞作用,可造成肝癌、慢性肝炎、黃疽肝炎、肝腫大以及肝硬化,其中黃曲霉毒素B1毒性和致癌性最強(qiáng)也最為多見。近年來隨著中藥材應(yīng)用量的攀增,研究人員在陳皮、杏仁、黃芪、地龍等多種中藥材中發(fā)現(xiàn)了黃曲霉菌污染超標(biāo)的現(xiàn)象,將有可能對使用安全造成嚴(yán)重威脅。因此,黃曲霉毒素污染是影響中藥飲用安全的重要問題,亟待解決。二、國內(nèi)外研究進(jìn)展傳統(tǒng)的產(chǎn)毒真菌分類鑒別一般采用形態(tài)學(xué)方法,但其要求鑒定者有較強(qiáng)的專業(yè)知識,并且存在鑒別準(zhǔn)確率低、用時長等缺點(diǎn),且鑒定者需較強(qiáng)的專業(yè)知識。而分子檢測方法因其高度準(zhǔn)確性,耗時短且客觀性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),在產(chǎn)毒真菌的種類檢測和鑒定方面得到了深入的研究和廣泛的應(yīng)用。目前已報道的產(chǎn)毒黃曲霉菌分子檢測方法包括D NA直接測序、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、多重PCR、熒光定量PC R等。但是,上述檢測方法均耗時較長,一般需要2小時以上,其中DNA測序則需更長時間,無法滿足當(dāng)前大樣本快速定性定量檢測的要求。因此,針對目前產(chǎn)毒黃曲霉菌的檢測,亟需一種更快速準(zhǔn)確的定性定量方法。目前,廣泛應(yīng)用的黃曲霉毒素檢測技術(shù)主要包括儀器分析方法和免疫學(xué)分析方法。儀器分析方法主要涉及薄層法、液相色譜法、氣相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用等,免疫學(xué)分析方法主要有酶聯(lián)免疫分析和側(cè)流層析檢測技術(shù)及其產(chǎn)品。然而,儀器分析方法需要復(fù)雜的樣本前處理,昂貴的儀器和具有大量專業(yè)知識的技術(shù)人員,無法同時檢測大量樣本。免疫分析方法雖然檢測時間有所縮短,但仍然在2小時以上,且檢測成本也較高。因此,亟需一種更快速、高效且成本低的檢測技術(shù)應(yīng)用于黃曲霉毒素的檢測。三、研究目標(biāo)1、建立"環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)"快速檢測中藥材中產(chǎn)毒黃曲霉菌。2、建立"熒光偏振免疫分析技術(shù)"快速定性定量檢測中藥材中黃曲霉毒素B1。3、同步高通量定性定量檢測中藥材中產(chǎn)毒黃曲霉菌及黃曲霉毒素。四、研究內(nèi)容與結(jié)果1、黃曲霉菌和中藥材中其他真菌的培養(yǎng)與鑒定。利用黃曲霉菌選擇培養(yǎng)基對中藥材中的黃曲霉菌進(jìn)行選擇性培養(yǎng),結(jié)合ITS條形碼及形態(tài)鑒定方法系統(tǒng)鑒定為黃曲霉菌(Asperqillus flavus)。本研究通過PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)中藥材中其他真菌,結(jié)合IT S條形碼及形態(tài)鑒定方法進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。2、建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法。本研究根據(jù)功能基因VER-1的外顯子序列設(shè)計環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增體系的擴(kuò)增引物,并優(yōu)化體系獲得穩(wěn)定高效的擴(kuò)增結(jié)果,在此基礎(chǔ)上結(jié)合實(shí)時熒光檢測技術(shù),成功建立了黃曲霉菌的實(shí)時環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法。3、建立了熒光定量PCR檢測方法。本研究通過對黃曲霉毒素生物合成關(guān)鍵基因設(shè)計特異引物,利用實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)對黃曲霉菌進(jìn)行定性定量檢測。4、建立了熒光偏振免疫分析檢測方法。本研究運(yùn)用化學(xué)合成的方法,將黃曲霉毒素與氨基熒光素結(jié)合,得到能與黃曲霉毒素抗體結(jié)合且具有熒光信號的熒光標(biāo)記物,并通過薄層色譜和質(zhì)譜對合成產(chǎn)物進(jìn)行確定。由于黃曲霉毒素和黃曲霉毒素?zé)晒鈽?biāo)記物與黃曲霉毒素抗體的結(jié)合存在相互競爭關(guān)系,并且與抗體結(jié)合前后分子量和旋轉(zhuǎn)速度會發(fā)生變化,從而引起熒光偏振數(shù)值的變化。本研究根據(jù)該原理測得熒光偏振數(shù)值建立線性回歸曲線,實(shí)現(xiàn)對黃曲霉毒素的定性定量檢測。5、建立了 HPLC檢測方法。本研究通過對黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化得到熒光信號更強(qiáng)更穩(wěn)定的衍生化產(chǎn)物,并利用高效液相方法通過熒光檢測器對其進(jìn)行定性定量分析。6、完成四個不同環(huán)節(jié)的六味代表性中藥材的72份樣品的收集和對中藥材樣品中黃曲霉菌和黃曲霉毒素的檢測。對采集得到的六味代表性中藥材共72份樣品,采用實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)檢測黃曲霉菌含量,采用熒光偏振和高效液相技術(shù)檢測黃曲霉菌毒素的含量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2420495