發(fā)布時(shí)間：2018-11-20 08:54

【摘要】：目的:腎細(xì)胞癌在成人泌尿系統(tǒng)腫瘤較為常見,惡性程度高、預(yù)后不良,而且約莫30%的患者在初次就診時(shí)就已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。而放療或者化療差強(qiáng)人意的療效,使手術(shù)成為腎癌目前最主要而有效的手段;然而采取手術(shù)治療的患者,有20%-40%后期繼發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。癌癥發(fā)生發(fā)展分子層面機(jī)理的認(rèn)識(shí)越來越清晰,以特定蛋白為靶標(biāo)的靶向治療(TARGET,treatment approaches in renal cancer global evaluation trial)成為新的研究熱點(diǎn)。以索拉非尼為例,TKI作用于VEGF,阻礙腫瘤中新血管的生成,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡式死亡。靶向藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的刺激會(huì)隨著用藥時(shí)間積累而發(fā)生質(zhì)變,導(dǎo)致對(duì)藥物抵抗耐藥,從而制約了靶向治療的應(yīng)用。本課題嘗試探討腎細(xì)胞癌靶向治療發(fā)生抵抗的機(jī)制,并探索改變其抵抗性的手段。實(shí)驗(yàn)選取腎癌細(xì)胞株786-0、ACHN以梯度索拉非尼濃度構(gòu)建耐藥株,通過對(duì)凋亡、自噬、信號(hào)通路的檢測(cè)探討可能的耐藥機(jī)制,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果探索逆轉(zhuǎn)耐藥性的方法。方法:1.耐藥株的建立:786-0、ACHN細(xì)胞株于96孔板中培養(yǎng)滴加不同濃度索拉非尼,采用WST-8測(cè)其IC50。隨后,細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加索拉非尼,以略低于IC50濃度開始,傳代時(shí)遴選活力最強(qiáng)的細(xì)胞,以兩代的頻率梯度增加索拉非尼的濃度。在索拉非尼的有效濃度達(dá)到8 μmol/L時(shí),保持此濃度,穩(wěn)定傳10代以后可認(rèn)為耐藥株構(gòu)建成功。2.對(duì)比檢測(cè)耐藥株786-0-R、ACHN-R與非耐藥株786-0、ACHN凋亡、自噬、Akt表達(dá)的差異,探討耐藥發(fā)生可能的機(jī)制。3.依據(jù)上一步結(jié)果,探尋逆轉(zhuǎn)腎癌細(xì)胞株耐藥的方法。通過與非耐藥株的對(duì)比,檢測(cè)其細(xì)胞的活力、凋亡、自噬水平等評(píng)估耐藥性,探討其背后的機(jī)制,驗(yàn)證前期研究。4.根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。構(gòu)建ACHN、ACHN-R荷瘤鼠模型,2周后可初步判斷植瘤成功與否。老鼠隨機(jī)分為5組,對(duì)照組,耐藥對(duì)照組,耐藥+索拉非尼組,耐藥+烏苯美司組,耐藥+索拉非尼+烏苯美司組。測(cè)量老鼠腫瘤體積,評(píng)測(cè)估計(jì)烏苯美司逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥的效用。結(jié)果:1.腎細(xì)胞癌耐藥株786-0-R、ACHN-R表現(xiàn)為對(duì)索拉非尼抵抗,同等劑量下,786-0-R、ACHN-R具有更低的凋亡率,表明耐藥株構(gòu)建成功。2.786-0-R、ACHN-R自噬水平明顯上升,自噬作為癌細(xì)胞的一種反應(yīng)機(jī)制參與索拉非尼耐藥。3.在 786-0-R、ACHN-R 中 PI3K/Akt/mT0R 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過度激活,p-Akt,p-mTOR的表達(dá)顯著增高。PI3K/Akt/mT0R轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與自噬、凋亡關(guān)系密不可分,在索拉非尼耐藥發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。4.應(yīng)用烏苯美司后,Akt信號(hào)通路表達(dá)下調(diào),與安慰劑對(duì)比,耐藥株加入烏苯美司后腎癌細(xì)胞又恢復(fù)了對(duì)索拉非尼的敏感性,與單純添加烏苯美司相比較,烏苯美司加索拉非尼的療效明顯優(yōu)于單純?yōu)醣矫浪?證實(shí)并非烏苯美司改變了耐藥株的抵抗性。結(jié)論:腎癌耐藥細(xì)胞株對(duì)索拉非尼反應(yīng)較差,WB、電鏡結(jié)果顯示較高的自噬水平,應(yīng)用烏苯美司調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路抑制自噬可以逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥,但其他靶向藥物耐藥、逆轉(zhuǎn)耐藥性的有效時(shí)間等問題需要更長(zhǎng)時(shí)間、更大樣本的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2344462