發(fā)布時間：2018-11-17 15:45

【摘要】：人胚胎干細胞(Human embryonic stem cells,hESCs)是一種多潛能干細胞,具有在體外無限增殖、自我更新和向機體各種類型細胞分化的能力。hESCs在特定條件下可分化為胰島素分泌細胞(Insulin-producing cells,IPCs),可以用于移植治療Ⅰ型糖尿病,以解決臨床治療器官來源不足的問題。MiR-375是胰腺發(fā)育和成熟過程中必不可少的轉錄調控因子,在胰島β細胞和非β細胞中均有表達,能夠提高胰島素轉錄水平,促進胰島β細胞增殖。因此,研究miR-375在hESCs向IPCs分化過程中的作用,對于提高hESCs向IPCs分化的效率,獲得單一表達Insulin的成熟胰島β細胞具有重要意義。本研究在特定條件下使hESCs向IPCs分化,分化過程包括終末內(nèi)胚層(Stage Ⅰ)、原腸(Stage Ⅱ)、內(nèi)分泌前體(Stage Ⅲ)和胰腺內(nèi)分泌細胞(Stage ⅣV)四個階段。先以分化體系中的維甲酸(Retinoic acid,RA)為變量優(yōu)化分化條件,再分別采用慢病毒介導的穩(wěn)定過表達和脂質體介導的瞬時過表達提高細胞miR-375的表達水平,通過實時定量PCR檢測miR-375和分化各階段標志性基因Foxa2、Cxcr4、Ngn3、Pdx1、Insulin、Glucagon、Somatostatin的相對表達量,并通過免疫熒光染色和Elisa檢測胰島素合成和分泌情況,從而研究過表達miR-375對hESCs分化為IPCs的影響。1、為了優(yōu)化hESCs分化為IPCs的培養(yǎng)條件,在終末內(nèi)胚層向內(nèi)分泌前體細胞分化的不同時間段添加2μMRA對細胞進行誘導,分別為不添加RA、在Stage Ⅱ 添加 RA、在 Stage Ⅲ 添加 RA、在 Stage Ⅱ 和 Stage Ⅲ 都添加 RA。研究發(fā)現(xiàn)在沒有RA誘導的條件下,hESCs未能成功分化為IPCs;在Stage Ⅱ添加RA的條件下,胰向分化相關基因Foxa2、Cxcr4、Ngn2、Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatoststin的相對表達量最高,并且在此條件下細胞一直保持良好的生長狀態(tài)。因此在細胞分化Stage Ⅱ添加2 μMRA可作為分化培養(yǎng)的最佳條件。2、通過對hESCs進行慢病毒介導的miR-375穩(wěn)定過表達,發(fā)現(xiàn)慢病毒感染會對hESCs的生長狀態(tài)造成極大影響,降低細胞增殖分化能力并增加細胞凋亡,使細胞在分化早期大量死亡,進而導致hESCs無法分化產(chǎn)生IPCs。3、對分化不同時期的hESCs進行脂質體介導的miR-375 mimic轉染,發(fā)現(xiàn)在分化早期過表達miR-375會提高Foxa2和Cxcr4的相對表達量,在分化中期過表達miR-375會提高Ngn3和Pdx1的相對表達量,在分化末期過表達miR-375會提高Insulin的相對表達量同時降低Glucagon和Somatostatin的相對表達量。并且瞬時過表達miR-375可促進胰島素的合成和分泌。因此,在hESCs向IPCs分化過程中過表達miR-375可提高胰島β細胞發(fā)育成熟相關基因的表達水平,降低分化末期細胞多激素共表達程度,促進β細胞成熟和胰島素分泌。
[Abstract]:Human embryonic stem cell (Human embryonic stem cells,hESCs) is a multipotent stem cell with unlimited proliferation in vitro. The ability to self-renew and differentiate into various types of cells in the body. HESCs can differentiate into insulin-secreting cells (Insulin-producing cells,IPCs) under certain conditions and can be used for transplantation in the treatment of type 1 diabetes. In order to solve the problem of insufficient organ source in clinical treatment, MiR-375 is an essential transcriptional regulator in the development and maturation of pancreas. It is expressed in both 尾 cells and non-beta cells of pancreatic islets, and can improve the level of insulin transcription. Promote the proliferation of islet 尾 cells. Therefore, it is of great significance to study the role of miR-375 in the differentiation of hESCs into IPCs, in order to improve the differentiation efficiency of hESCs into IPCs and to obtain mature islet 尾 cells with single expression of Insulin. In this study, hESCs was differentiated into IPCs under certain conditions. The differentiation process consisted of four stages: Stage 鈪，

本文編號：2338346