【摘要】：茯苓類藥材來源于多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核。根據(jù)入藥部位和功效不同,常分為茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神四種。茯苓皮是茯苓菌核的外皮部分,有利水消腫之功效;赤茯苓為茯苓菌核近外表皮部淡紅色部分,有行水利濕熱、益心潤肺之功效;茯苓為菌核中間白色部分,有利水滲濕、益脾和胃之功效;茯神為菌核中心抱有松根部分,有寧心、安神、利水之功效。隨著茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神入藥部位由表及里,其行水利尿作用逐漸減弱而寧心安神作用增強�；瘜W(xué)成分研究表明茯苓三萜類化合物是茯苓類藥材的主要活性物質(zhì),種類多樣。目前為止,茯苓不同藥用部位的茯苓三萜類化合物在體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)差異尚無系統(tǒng)研究,因此尚不明確造成茯苓類藥材功效之間差異的具體化學(xué)成分和作用機制。本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),建立一個可同時定量分析大鼠血漿中多種茯苓三萜類化合物的方法,應(yīng)用于比較茯苓類藥材在大鼠體內(nèi)藥物動力學(xué)方面的差異,并發(fā)現(xiàn)和鑒定茯苓皮提取液在大鼠體內(nèi)的代謝物,推測可能的代謝途徑。第一部分茯苓類藥材中茯苓三萜類化合物的藥物動力學(xué)比較目的:建立生物樣品中茯苓類藥材8種茯苓三萜類化合物的UHPLC-Q-TOF-MS/MS定量測定方法,研究茯苓類藥材在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征,初步探討其藥物動力學(xué)的差異。方法:1茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮灌胃液的制備:將茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮用90%乙醇加熱回流提取,提取液過濾,減壓除醇,加適量水溶解,分別制備成茯神灌胃液(相當(dāng)于2.5 g/m L原藥材)、茯苓灌胃液(相當(dāng)于2.5 g/m L原藥材)、赤茯苓灌胃液(相當(dāng)于2.0 g/m L原藥材)、茯苓皮灌胃液(相當(dāng)于2.0 g/m L原藥材)。2生物樣品的采集和預(yù)處理:取24只250±30 g的雄性Sprague-Dawley大鼠,隨機分為4組,按體重以生藥材25 g/kg的給藥量,分別灌胃給予上述4種溶液。茯神、茯苓、茯苓皮分別于給藥后5 min,10 min,30 min,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h,36 h,48 h;赤茯苓于給藥后10 min,30 min,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h,36 h,48 h,72h眼內(nèi)眥靜脈叢取血,采用乙腈沉蛋白的方法處理血漿樣品。3樣品分析條件:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)。ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1×100 mm,5μm)色譜柱。流動相為0.5‰甲酸-0.5 m M乙酸銨水溶液和乙腈。ESI電離,子離子掃描模式,在負離子模式下檢測茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、茯苓新酸AM、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、常春藤皂苷元。采用高分辨的單個子離子計算峰面積,并采用內(nèi)標(biāo)法加權(quán)(1/x~2)一元線性回歸定量。4藥物動力學(xué)研究與分析:根據(jù)測定結(jié)果,繪制藥時曲線,采用DAS3.0非房室模型計算藥物動力學(xué)參數(shù),并比較4種藥材給藥的藥物動力學(xué)差異。結(jié)果:大鼠血漿中茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、茯苓新酸AM、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在測定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.9930)。批內(nèi)、批間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10.3%,相對誤差(RE)為-6.1%~7.7%。基質(zhì)效應(yīng)于91.4%~112.3%范圍內(nèi),平均提取回收率為72.6%~102.6%。茯苓新酸AM在各組中均無吸收,茯苓新酸B、去氫土莫酸、茯苓新酸A、豬苓酸C、去氫茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在茯苓皮組中吸收量最大。結(jié)論:本方法快速、靈敏、專屬、穩(wěn)定,可以用于茯苓類藥材在體內(nèi)成分的測定,為研究茯苓類藥材藥理作用機制提供了依據(jù)。第二部分茯苓皮在大鼠體內(nèi)吸收組分和代謝物的鑒定目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),結(jié)合Peakview和Metabolite Pilot數(shù)據(jù)分析軟件,分析鑒定茯苓皮在大鼠血漿、膽汁和尿液中的吸收組分和代謝物,探索其活性成分在體內(nèi)的代謝途徑。方法:1茯苓皮灌胃液的制備:將茯苓皮用90%乙醇加熱回流提取,提取液過濾,減壓除醇,用水稀釋至相當(dāng)于2.0 g/m L的原藥材。2生物樣品的采集和預(yù)處理:取12只雄性Sprague-Dawley大鼠,體重250±30 g,隨機分為4組,每組3只,按體重以25 g/kg的給藥量灌胃給予大鼠,分別采集給藥后1、2、4、8、12、24和36 h時的血漿樣品,24 h的膽汁樣品和72 h的尿液,分別合并所有的血漿、膽汁樣品和尿樣。將合并的生物樣品分別用3倍量的乙酸乙酯萃取,萃取3次,每次15 min。合并乙酸乙酯層,減壓干燥,殘渣用甲醇溶解。3樣品分析條件:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析樣品。色譜柱為Phenomenex Luna 3μC18(2)100A(150×2.0 mm),流動相為2mmol/L的乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和乙腈,梯度洗脫;高分辨質(zhì)譜采用ESI源,負離子模式,全掃描采集,采用動態(tài)背景扣除和信息依賴采集觸發(fā)二級碎片的采集,每一循環(huán)采集8個最強峰的二級質(zhì)譜圖。4代謝物發(fā)現(xiàn)和鑒定的步驟:首先結(jié)合文獻,建立茯苓皮中茯苓三萜類已知化合物的信息庫。然后用Peakview 2.0軟件尋找血漿中的吸收組分、膽汁和尿樣中的原型藥物。再將這些吸收組分按照結(jié)構(gòu)特點進行分類,選擇有對照品且吸收量較大的化合物作為母藥,用Metabolite Pilot 1.5軟件以母藥為模板進行分析,尋找生物樣品中主要代謝物。最后根據(jù)茯苓三萜類的裂解規(guī)律和化合物的極性,解析代謝物的結(jié)構(gòu),及其可能的代謝轉(zhuǎn)化途徑。結(jié)果:通過Peakview 2.0,在血漿中尋找到15種主要的吸收組分;按結(jié)構(gòu)將其分為4類,其中3類分別以茯苓酸、茯苓新酸A和去氫土莫酸為母藥;利用Metabolite Pilot 1.5軟件進行數(shù)據(jù)分析,尋找并初步鑒定其代謝物,共鑒定出102種成分,主要的代謝類型為甲基化、氧化、水解、氫化和葡萄糖醛酸結(jié)合等。結(jié)論:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù),成功發(fā)現(xiàn)和鑒定了茯苓皮大鼠體內(nèi)代謝物,為茯苓皮體內(nèi)過程的闡明奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285.5

【參考文獻】

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