【摘要】：目的:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)作為可以轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并激活轉(zhuǎn)錄因子的蛋白激酶,是眾多信號(hào)通路的“瓶頸”和匯集點(diǎn)。近年來發(fā)現(xiàn)抑制ERK信號(hào)通路,從而抑制HSCs活化與增殖,是目前治療肝纖維化比較理想的選擇。本實(shí)驗(yàn)通過檢測山芝麻酸甲酯(methyl helicterate,MH)對(duì)ERK信號(hào)通路上游靶位Raf、ERK1/2的表達(dá)及其磷酸化水平的影響和對(duì)轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達(dá)的影響,探討其體外抗肝纖維化的分子機(jī)制。方法:HSC-T6、LX2和7702選為本實(shí)驗(yàn)采用的肝星狀細(xì)胞,體外培養(yǎng)。用不同濃度MH作用于細(xì)胞,CCK-8試劑盒法檢測MH對(duì)細(xì)胞的毒性作用;10 ng/m L PDGF-BB,50μM PD98059及MH作用于細(xì)胞后,CCK-8試劑盒法、LDH法、劃痕實(shí)驗(yàn)、集落生成法、AO-EB染色和AnnexinⅤ-FITC/PI分別觀察細(xì)胞增殖、LDH活力、遷移、集落形成、凋亡及細(xì)胞周期;RT-PCR法觀察ERK1、ERK2、Raf、c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1 m RNA的表達(dá);Western bolt免疫印跡法觀察細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2和Raf、p-Raf的表達(dá)。免疫組化法觀察細(xì)胞c-fos、c-jun、c-myc、Ets-1和I型膠原(Col-I)、Col-Ⅲ的表達(dá)。結(jié)果:(1)MH對(duì)PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、LDH活性、遷移、集落形成、凋亡及細(xì)胞周期的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),外源性刺激因子PDGF-BB刺激的模型組與正常對(duì)照組比較,細(xì)胞在24 h處增殖明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;12.5、25、50μg/m L的MH作用組與刺激組比較均能抑制細(xì)胞增殖,呈濃度依賴性(P0.05或P0.01)。與正常組比較,PDGF-BB刺激組細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)、LDH活性明顯減弱(P0.01),細(xì)胞遷移及集落生成分別加快、增多,細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期均無明顯改變;經(jīng)藥物干預(yù)后,PD98059和MHL、MHM、MHH能明顯抑制細(xì)胞增殖、遷移及集落的生成,提高LDH活性,此外,還引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化,提高細(xì)胞的凋亡率,誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G2期(P0.05或P0.01)。以上結(jié)果表明,MH能明顯抑制肝星狀細(xì)胞的增殖、遷移及集落的生成,并促進(jìn)其凋亡。因而,證實(shí)了MH抗肝纖維化的調(diào)控機(jī)制與抑制肝星狀細(xì)胞的增殖有關(guān),為其靶向防御肝纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。(2)MH對(duì)PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞Col-I和Col-Ⅲ表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示,與正常組比較,PDGF刺激組細(xì)胞Col-Ⅲ合成和分泌明顯增多,Col-I含量升高。經(jīng)藥物干預(yù)后,PD98059和MHL、MHM、MHH能顯著抑制Col-Ⅲ的合成和分泌,降低Col-I含量。結(jié)果提示,MH抗肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與其抑制肝星狀細(xì)胞膠原的合成與沉積密切相關(guān)。(3)MH對(duì)PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路上游靶位Raf以及ERK1/2的表達(dá)及其磷酸化水平的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PDGF可顯著上調(diào)肝星狀細(xì)胞Raf以及ERK1/2 m RNA的表達(dá)(P0.01)。Western Blot結(jié)果顯示,PDGF刺激組細(xì)胞Raf、p-Raf以及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增(P0.01)。經(jīng)藥物干預(yù)后,PD98059與MH均能顯著下調(diào)細(xì)胞Raf、ERK1/2 m RNA和Raf、p-Raf及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)(P0.05或P0.01)�？梢�,MH能顯著抑制肝星狀細(xì)胞Raf及ERK1/2的表達(dá)和磷酸化水平,降低上游靶位ERK的活性,對(duì)ERK信號(hào)通路有明顯的抑制作用。(4)MH對(duì)PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PDGF刺激組細(xì)胞c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 m RNA表達(dá)明顯高于正常組(P0.01)。經(jīng)藥物干預(yù)后,PD98059與MH均能顯著下調(diào)細(xì)胞c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 m RNA水(P0.05或P0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果,顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1陽性染色細(xì)胞增多濃染。經(jīng)藥物干預(yù)后,PD98059與MH細(xì)胞質(zhì)內(nèi)c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1陽性染色細(xì)胞數(shù)減少淡染。這表明,MH能抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達(dá),其能抑制ERK活化,阻滯了ERK通路信號(hào)傳導(dǎo)。結(jié)論:MH能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá),阻滯細(xì)胞在G2期,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;MH可調(diào)控Raf及ERK1、ERK2 m RNA的水平,抑制Raf及ERK1/2及其磷酸化和c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達(dá)。以上結(jié)果表明,MH能明顯抑制肝星狀細(xì)胞的活化,其機(jī)制可能與抑制ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2320848