【摘要】：目的:細胞外信號調節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)作為可以轉移至細胞核并激活轉錄因子的蛋白激酶,是眾多信號通路的“瓶頸”和匯集點。近年來發(fā)現抑制ERK信號通路,從而抑制HSCs活化與增殖,是目前治療肝纖維化比較理想的選擇。本實驗通過檢測山芝麻酸甲酯(methyl helicterate,MH)對ERK信號通路上游靶位Raf、ERK1/2的表達及其磷酸化水平的影響和對轉錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達的影響,探討其體外抗肝纖維化的分子機制。方法:HSC-T6、LX2和7702選為本實驗采用的肝星狀細胞,體外培養(yǎng)。用不同濃度MH作用于細胞,CCK-8試劑盒法檢測MH對細胞的毒性作用;10 ng/m L PDGF-BB,50μM PD98059及MH作用于細胞后,CCK-8試劑盒法、LDH法、劃痕實驗、集落生成法、AO-EB染色和AnnexinⅤ-FITC/PI分別觀察細胞增殖、LDH活力、遷移、集落形成、凋亡及細胞周期;RT-PCR法觀察ERK1、ERK2、Raf、c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1 m RNA的表達;Western bolt免疫印跡法觀察細胞ERK1/2、p-ERK1/2和Raf、p-Raf的表達。免疫組化法觀察細胞c-fos、c-jun、c-myc、Ets-1和I型膠原(Col-I)、Col-Ⅲ的表達。結果:(1)MH對PDGF誘導的細胞增殖、LDH活性、遷移、集落形成、凋亡及細胞周期的影響實驗結果發(fā)現,外源性刺激因子PDGF-BB刺激的模型組與正常對照組比較,細胞在24 h處增殖明顯,差異有統(tǒng)計學意義;12.5、25、50μg/m L的MH作用組與刺激組比較均能抑制細胞增殖,呈濃度依賴性(P0.05或P0.01)。與正常組比較,PDGF-BB刺激組細胞增殖明顯增強、LDH活性明顯減弱(P0.01),細胞遷移及集落生成分別加快、增多,細胞形態(tài)學、細胞凋亡率和細胞周期均無明顯改變;經藥物干預后,PD98059和MHL、MHM、MHH能明顯抑制細胞增殖、遷移及集落的生成,提高LDH活性,此外,還引起細胞形態(tài)學發(fā)生變化,提高細胞的凋亡率,誘導細胞阻滯于G2期(P0.05或P0.01)。以上結果表明,MH能明顯抑制肝星狀細胞的增殖、遷移及集落的生成,并促進其凋亡。因而,證實了MH抗肝纖維化的調控機制與抑制肝星狀細胞的增殖有關,為其靶向防御肝纖維化提供了實驗依據和理論支持。(2)MH對PDGF誘導的細胞Col-I和Col-Ⅲ表達的影響免疫組化結果顯示,與正常組比較,PDGF刺激組細胞Col-Ⅲ合成和分泌明顯增多,Col-I含量升高。經藥物干預后,PD98059和MHL、MHM、MHH能顯著抑制Col-Ⅲ的合成和分泌,降低Col-I含量。結果提示,MH抗肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與其抑制肝星狀細胞膠原的合成與沉積密切相關。(3)MH對PDGF誘導的細胞信號通路上游靶位Raf以及ERK1/2的表達及其磷酸化水平的影響實時熒光定量PCR實驗結果表明,PDGF可顯著上調肝星狀細胞Raf以及ERK1/2 m RNA的表達(P0.01)。Western Blot結果顯示,PDGF刺激組細胞Raf、p-Raf以及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達明顯增(P0.01)。經藥物干預后,PD98059與MH均能顯著下調細胞Raf、ERK1/2 m RNA和Raf、p-Raf及ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(P0.05或P0.01)�？梢�,MH能顯著抑制肝星狀細胞Raf及ERK1/2的表達和磷酸化水平,降低上游靶位ERK的活性,對ERK信號通路有明顯的抑制作用。(4)MH對PDGF誘導的細胞轉錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達的影響實時熒光定量PCR實驗結果顯示,PDGF刺激組細胞c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 m RNA表達明顯高于正常組(P0.01)。經藥物干預后,PD98059與MH均能顯著下調細胞c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1 m RNA水(P0.05或P0.01)。免疫細胞化學染色結果,顯示細胞質內c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1陽性染色細胞增多濃染。經藥物干預后,PD98059與MH細胞質內c-fos、c-jun、c-myc及Ets-1陽性染色細胞數減少淡染。這表明,MH能抑制細胞轉錄因子c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達,其能抑制ERK活化,阻滯了ERK通路信號傳導。結論:MH能抑制PDGF-BB誘導的細胞增殖,Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達,阻滯細胞在G2期,誘導細胞凋亡;MH可調控Raf及ERK1、ERK2 m RNA的水平,抑制Raf及ERK1/2及其磷酸化和c-fos、c-jun、c-myc和Ets-1表達。以上結果表明,MH能明顯抑制肝星狀細胞的活化,其機制可能與抑制ERK1/2信號通路有關。
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【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2320848