【摘要】：日本乙型腦炎是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染引起的神經(jīng)性疾病。該病主要分布在南亞和東南亞地區(qū),現(xiàn)已成為該地區(qū)主要流行的病毒性腦炎。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),JEV感染每年可導(dǎo)致約10000-15000人死亡。但并不是所有的JEV感染都能夠引起發(fā)病,僅有少數(shù)(大約1:300)感染的個體表現(xiàn)腦炎的癥狀。因此,這些腦炎的病例說明,在從外周擴(kuò)散入腦的過程中,JEV可通過某種機(jī)制逃逸宿主的免疫監(jiān)視。已有的研究顯示,外周血單核細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞及其前體細(xì)胞在這個過程中發(fā)揮一定的作用,表現(xiàn)為:1)可以從外周單核細(xì)胞中分離獲得JEV;2)JEV可以在巨噬細(xì)胞中存活。所以,從某種意義上講,JEV與巨噬細(xì)胞相互作用很可能會影響JE的發(fā)生。巨噬細(xì)胞是機(jī)體的主要免疫細(xì)胞,在宿主的先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)中都起著重要的作用。其生物學(xué)功能因激活狀態(tài)不同而受到影響,目前,巨噬細(xì)胞根據(jù)激活狀態(tài)主要分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞,前者主要由Th1型細(xì)胞因子如γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)等誘導(dǎo)產(chǎn)生,后者主要由Th2型細(xì)胞因子如IL-4(Interleukin-4)等誘導(dǎo)產(chǎn)生。體外的研究顯示,相對于非免疫細(xì)胞如Vero細(xì)胞(Verda Reno,非洲綠猴腎細(xì)胞)、MEF(Mouse Embryonic Fibroblast,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)等,巨噬細(xì)胞顯示出明顯的抑制JEV作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞可以通過促進(jìn)一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制。但是,目前對M2型巨噬細(xì)胞是如何影響JEV感染的機(jī)制還不清楚。有趣的是,研究發(fā)現(xiàn)Th2免疫反應(yīng)對JEV引起的腦炎具有保護(hù)作用。目的:為了闡明不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對JEV感染的影響,尤其是對JEV強(qiáng)毒株感染的影響,有以下2個研究目的,(1)明確JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體內(nèi)和體外的感染特性;(2)解析不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對JEV強(qiáng)毒株NJ2008感染的影響。方法:(1)為了明確JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體內(nèi)和體外的感染特性,首先,用C6/36細(xì)胞增殖NJ2008,并通過TCID50測定分析病毒滴度。其次,通過腹腔感染C57BL/6小鼠測定生存曲線。隨后,利用TCID50測定、Western Blot以及間接免疫熒光法對JEV腦部感染情況進(jìn)行分析。最后,對JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體外的感染特性進(jìn)行了分析,包括:1)利用TCID50測定分析比較了NJ2008在BHK-21和巨噬細(xì)胞RAW264.7上的一步生長曲線;2)利用間接免疫熒光法分析比較了NJ2008在以上兩種細(xì)胞上的感染情況。(2)為了解析不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對JEV強(qiáng)毒株NJ2008感染的影響,首先,利用細(xì)胞因子(IL-4或IFN-γ)處理RAW264.7細(xì)胞,通過熒光定量PCR檢測巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志分子(i NOS和Arg-1)以及細(xì)胞因子(CXCL-10和TNF-α)的變化情況,確定巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài);然后通過TCID50、免疫熒光技術(shù)和熒光定量PCR方法比較JEV強(qiáng)毒株NJ2008在不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞上的感染情況。結(jié)果:(1)JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體內(nèi)和體外的感染特性分析:首先,利用TCID50測定對增殖的病毒進(jìn)行分析,計(jì)算獲得病毒的滴度為8.3×108 TCID50/0.1 m L。其次,通過腹腔感染C57BL/6小鼠測定生存曲線,發(fā)現(xiàn)以8.3×104 TCID50/100μL/小鼠進(jìn)行感染,于感染后7天到14天死亡率超過60%。隨后,對發(fā)病小鼠腦的感染情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)的病毒滴度超過107 TCID50/腦,進(jìn)一步,Western Blot以及間接免疫熒光法(IFA)分析顯示腦內(nèi)JEV感染陽性。最后,對JEV強(qiáng)毒株NJ2008在體外的感染特性進(jìn)行了分析,一步生長曲線的結(jié)果顯示于感染后24小時病毒的滴度達(dá)到高峰,然而,相對于BHK-21中的感染情況,JEV在RAW264.7中的感染顯著降低,進(jìn)一步的IFA檢測結(jié)果顯示JEV在BHK-21中的感染率明顯高于在RAW264.7中的感染率。(2)不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對JEV強(qiáng)毒株NJ2008感染的影響:首先,通過熒光定量PCR檢測,我們發(fā)現(xiàn),相對于PBS處理組,IFN-γ處理組顯著上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志分子i NOS,同時顯著上調(diào)CXCL-10和TNF-α的表達(dá),說明成功將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞;另外,相對于PBS處理組,IL-4處理組顯著上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞標(biāo)志分子Arg-1,同時抑制炎性因子CXCL-10和TNF-α的表達(dá),說明成功將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞;其次,我們利用上述細(xì)胞對JEV感染情況進(jìn)行了分析,雖然JEV在M2型巨噬細(xì)胞上的感染與PBS組沒有明顯的變化,但是,其在M1型巨噬細(xì)胞上的感染顯著受到了抑制。因此,以上結(jié)果明確了不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對JEV感染的影響,并顯示NO的上調(diào)表達(dá)在M1型巨噬細(xì)胞抑制JEV感染中起著主導(dǎo)作用。結(jié)論:我們的研究明確了M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞對JEV感染的作用。進(jìn)一步研究顯示,M1型巨噬細(xì)胞可顯著地抑制JEV的感染,即通過促進(jìn)NO的產(chǎn)生抑制JEV的復(fù)制。雖然M2型巨噬細(xì)胞在抑制JEV感染方面不如M1型巨噬細(xì)胞明顯,但是,在JEV腦內(nèi)感染中,Th2免疫反應(yīng)對JEV腦內(nèi)感染具有保護(hù)作用。M2型巨噬細(xì)胞在這個過程中是否發(fā)揮了重要作用,尚不清楚,這些疑問將在今后的研究中進(jìn)行探討�？傊�,我們的結(jié)果明確了不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對JEV感染的作用。該研究結(jié)果不僅豐富了JEV與巨噬細(xì)胞相互作用的知識,而且為將來進(jìn)一步揭示巨噬細(xì)胞作為一種抗原提呈細(xì)胞在JEV感染中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2307986