【摘要】：鉻(Cr),作為一種銀灰色金屬,在自然界中存在二價(jià)、三價(jià)和六價(jià)三種價(jià)態(tài)。六價(jià)鉻毒性最大,國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)1990年就將六價(jià)鉻列為確認(rèn)的I類(lèi)致癌物。大量流行病學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,暴露在環(huán)境中的六價(jià)鉻化合物與多種癌癥和腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。研究表明,低劑量的六價(jià)鉻可以誘導(dǎo)自噬,其機(jī)制是通過(guò)吞噬腫瘤細(xì)胞受損的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)蛋白,并將其降解成細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)再循環(huán)利用,維持腫瘤細(xì)胞活性,提高腫瘤細(xì)胞增殖率,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。自噬可以誘發(fā)腫瘤,并為其提供一個(gè)低氧氣和營(yíng)養(yǎng)限制的條件,此過(guò)程需要自噬相關(guān)蛋白(ATG)協(xié)調(diào)參與。HMGA2在不同的生物學(xué)過(guò)程中具有關(guān)鍵意義。HMGA2在許多惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氯化鎘(Cd Cl2)通過(guò)誘導(dǎo)ROS的形成引起了HMGA2表達(dá)上調(diào),而HMGA2表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致了MRC-5細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的變化。我們也發(fā)現(xiàn)了,氯化鎘引起細(xì)胞增殖的濃度同樣誘導(dǎo)了細(xì)胞發(fā)生自噬�，F(xiàn)階段沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道HMGA2在自噬中的作用,且低劑量重鉻酸鉀誘導(dǎo)自噬的機(jī)制也在探索階段。因此,本研究以重鉻酸鉀作為研究對(duì)象,探討HMGA2在重鉻酸鉀所引起的自噬中的作用。目的:研究低濃度的重鉻酸鉀對(duì)自噬的影響,及HMGA2在重鉻酸鉀誘導(dǎo)自噬中的可能分子機(jī)制。方法:本研究以人肺腺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)和人胚腎細(xì)胞(HEK 293細(xì)胞)作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以BALB/c小鼠作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀ALB/c小鼠經(jīng)重鉻酸鉀處理后,利用蛋白質(zhì)印跡法觀(guān)察小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白、HMGA1和HMGA2蛋白的表達(dá)情況。利用透射電子顯微鏡檢測(cè)重鉻酸鉀對(duì)小鼠肺組織自噬小體數(shù)量的影響。利用MTT法檢測(cè)重鉻酸鉀對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖率的影響,及自噬干預(yù)劑3-MA預(yù)處理后染毒重鉻酸鉀的A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖率的變化。利用吖啶橙染色和透射電子顯微鏡觀(guān)察重鉻酸鉀對(duì)A549細(xì)胞自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的影響,利用蛋白質(zhì)印跡法觀(guān)察自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。運(yùn)用si RNA干擾技術(shù),檢測(cè)HMGA2對(duì)重鉻酸鉀所引起的細(xì)胞自噬的影響。利用吖啶橙染色和透射電子顯微鏡觀(guān)察HMGA2對(duì)重鉻酸鉀處理的A549細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的影響,利用蛋白質(zhì)印跡法觀(guān)察HMGA2對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響,q PCR實(shí)驗(yàn)觀(guān)察HMGA2對(duì)Atg5和Atg12基因的表達(dá)情況的影響。在HEK 293細(xì)胞轉(zhuǎn)入pc DNA 3.1-HMGA2質(zhì)粒,通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法觀(guān)察HMGA2對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果:重鉻酸鉀處理的BALB/c小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白(LC3II、p62、Atg12-Atg5、Atg4、Atg5、Atg7、Atg12、Beclin 1)、HMGA1和HMGA2蛋白的表達(dá)量均升高(P0.05,P0.01)。透射電子顯微鏡觀(guān)察的結(jié)果也顯示染毒組小鼠肺組織自噬小體數(shù)量增加(P0.01),說(shuō)明重鉻酸鉀誘導(dǎo)BALB/c小鼠肺組織自噬。低濃度重鉻酸鉀(0.1、0.2μM)作用A549細(xì)胞24小時(shí)后,吖啶橙染色和透射電子顯微鏡結(jié)果可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的顯著增加(P0.01),自噬相關(guān)蛋白(LC3II、Atg12-Atg5、Atg4)、HMGA1和HMGA2的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05,P0.01),p62蛋白表達(dá)水平下降。說(shuō)明低濃度重鉻酸鉀誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬。在HMGA2 si RNA處理的A549細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn),自噬溶酶體和自噬小體的數(shù)量減少、LC3II和Atg12-Atg5蛋白表達(dá)水平降低,p62蛋白降解抑制,但Atg5和Atg12蛋白水平無(wú)明顯變化。說(shuō)明HMGA2可能是通過(guò)Atg12-Atg5偶聯(lián)蛋白調(diào)控重鉻酸鉀誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。為了證明我們的觀(guān)點(diǎn),利用q PCR實(shí)驗(yàn),分析證實(shí)Atg5和Atg12基因的表達(dá)量并不隨著HMGA2的變化而改變。在HEK 293細(xì)胞中,可以檢測(cè)到隨著HMGA2表達(dá)量的升高,LC3II和Atg12-Atg5蛋白表達(dá)水平升高,p62表達(dá)水平下降,Atg5和Atg12蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。上述結(jié)果表明,HMGA2是通過(guò)調(diào)節(jié)Atg12-Atg5偶聯(lián)結(jié)合從而促進(jìn)重鉻酸鉀誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。結(jié)論:HMGA2誘導(dǎo)Atg12-Atg5蛋白的偶聯(lián),是重鉻酸鉀誘導(dǎo)自噬的主要機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2292632