【摘要】：鉻(Cr),作為一種銀灰色金屬,在自然界中存在二價、三價和六價三種價態(tài)。六價鉻毒性最大,國際癌癥研究機構(gòu)1990年就將六價鉻列為確認的I類致癌物。大量流行病學研究和動物實驗研究表明,暴露在環(huán)境中的六價鉻化合物與多種癌癥和腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。研究表明,低劑量的六價鉻可以誘導自噬,其機制是通過吞噬腫瘤細胞受損的細胞器和細胞質(zhì)蛋白,并將其降解成細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)再循環(huán)利用,維持腫瘤細胞活性,提高腫瘤細胞增殖率,促進腫瘤的發(fā)生。自噬可以誘發(fā)腫瘤,并為其提供一個低氧氣和營養(yǎng)限制的條件,此過程需要自噬相關(guān)蛋白(ATG)協(xié)調(diào)參與。HMGA2在不同的生物學過程中具有關(guān)鍵意義。HMGA2在許多惡性腫瘤中過表達。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氯化鎘(Cd Cl2)通過誘導ROS的形成引起了HMGA2表達上調(diào),而HMGA2表達上調(diào)導致了MRC-5細胞周期和細胞增殖的變化。我們也發(fā)現(xiàn)了,氯化鎘引起細胞增殖的濃度同樣誘導了細胞發(fā)生自噬。現(xiàn)階段沒有文獻報道HMGA2在自噬中的作用,且低劑量重鉻酸鉀誘導自噬的機制也在探索階段。因此,本研究以重鉻酸鉀作為研究對象,探討HMGA2在重鉻酸鉀所引起的自噬中的作用。目的:研究低濃度的重鉻酸鉀對自噬的影響,及HMGA2在重鉻酸鉀誘導自噬中的可能分子機制。方法:本研究以人肺腺癌細胞(A549細胞)和人胚腎細胞(HEK 293細胞)作為體外實驗模型,以BALB/c小鼠作為體內(nèi)實驗模型。BALB/c小鼠經(jīng)重鉻酸鉀處理后,利用蛋白質(zhì)印跡法觀察小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白、HMGA1和HMGA2蛋白的表達情況。利用透射電子顯微鏡檢測重鉻酸鉀對小鼠肺組織自噬小體數(shù)量的影響。利用MTT法檢測重鉻酸鉀對A549細胞的細胞增殖率的影響,及自噬干預劑3-MA預處理后染毒重鉻酸鉀的A549細胞的細胞增殖率的變化。利用吖啶橙染色和透射電子顯微鏡觀察重鉻酸鉀對A549細胞自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的影響,利用蛋白質(zhì)印跡法觀察自噬相關(guān)蛋白表達的變化。運用si RNA干擾技術(shù),檢測HMGA2對重鉻酸鉀所引起的細胞自噬的影響。利用吖啶橙染色和透射電子顯微鏡觀察HMGA2對重鉻酸鉀處理的A549細胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的影響,利用蛋白質(zhì)印跡法觀察HMGA2對自噬相關(guān)蛋白表達量的影響,q PCR實驗觀察HMGA2對Atg5和Atg12基因的表達情況的影響。在HEK 293細胞轉(zhuǎn)入pc DNA 3.1-HMGA2質(zhì)粒,通過蛋白質(zhì)印跡法觀察HMGA2對自噬相關(guān)蛋白表達量的影響。結(jié)果:重鉻酸鉀處理的BALB/c小鼠肺組織自噬相關(guān)蛋白(LC3II、p62、Atg12-Atg5、Atg4、Atg5、Atg7、Atg12、Beclin 1)、HMGA1和HMGA2蛋白的表達量均升高(P0.05,P0.01)。透射電子顯微鏡觀察的結(jié)果也顯示染毒組小鼠肺組織自噬小體數(shù)量增加(P0.01),說明重鉻酸鉀誘導BALB/c小鼠肺組織自噬。低濃度重鉻酸鉀(0.1、0.2μM)作用A549細胞24小時后,吖啶橙染色和透射電子顯微鏡結(jié)果可見細胞內(nèi)自噬溶酶體和自噬小體數(shù)量的顯著增加(P0.01),自噬相關(guān)蛋白(LC3II、Atg12-Atg5、Atg4)、HMGA1和HMGA2的蛋白表達水平顯著升高(P0.05,P0.01),p62蛋白表達水平下降。說明低濃度重鉻酸鉀誘導A549細胞自噬。在HMGA2 si RNA處理的A549細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn),自噬溶酶體和自噬小體的數(shù)量減少、LC3II和Atg12-Atg5蛋白表達水平降低,p62蛋白降解抑制,但Atg5和Atg12蛋白水平無明顯變化。說明HMGA2可能是通過Atg12-Atg5偶聯(lián)蛋白調(diào)控重鉻酸鉀誘導的細胞自噬。為了證明我們的觀點,利用q PCR實驗,分析證實Atg5和Atg12基因的表達量并不隨著HMGA2的變化而改變。在HEK 293細胞中,可以檢測到隨著HMGA2表達量的升高,LC3II和Atg12-Atg5蛋白表達水平升高,p62表達水平下降,Atg5和Atg12蛋白的表達水平無明顯差異。上述結(jié)果表明,HMGA2是通過調(diào)節(jié)Atg12-Atg5偶聯(lián)結(jié)合從而促進重鉻酸鉀誘導的細胞自噬。結(jié)論:HMGA2誘導Atg12-Atg5蛋白的偶聯(lián),是重鉻酸鉀誘導自噬的主要機制。
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【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R114

【參考文獻】

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本文編號：2292632