【摘要】：板藍(lán)根是十字花科植物菘藍(lán)的干燥根,具有清熱解毒,涼血利咽之功效,臨床多用于治療各種病毒感染引起的疾病。目前,對(duì)于板藍(lán)根抗病毒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究有了一定進(jìn)展,但仍沒(méi)有發(fā)現(xiàn)確切的抗病毒藥效成分。研究中的問(wèn)題集中體現(xiàn)在:(1)體外研究較多,體內(nèi)研究較少。(2)化學(xué)成分研究較多,但抗病毒相關(guān)活性篩選不夠全面。(3)單純抗病毒研究較多,但整體調(diào)控作用研究較少。本課題針對(duì)以上三個(gè)問(wèn)題展開相關(guān)研究,為板藍(lán)根藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)和抗病毒藥理作用機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。(1)板藍(lán)根血清藥物化學(xué)研究。利用HPLC法對(duì)血漿樣品的前處理和色譜條件進(jìn)行了全面考察,建立了板藍(lán)根水提液含藥血漿的指紋圖譜,板藍(lán)根水提液含藥血漿樣品與空白血漿樣品圖譜對(duì)照,初步確定了板藍(lán)根灌胃給藥后的含藥血漿中主要含有10個(gè)移行成分。采用LC-MS技術(shù)分析了板藍(lán)根水提液、空白血漿、含藥血漿中的化學(xué)成分,最終在板藍(lán)根水提液中鑒定出59個(gè)化學(xué)成分;含藥血漿圖譜以空白血漿圖譜為背景進(jìn)行扣除背景處理,并以板藍(lán)根水提液中檢測(cè)到的59個(gè)化學(xué)成分為數(shù)據(jù)庫(kù),運(yùn)用XIC Manager功能對(duì)扣除背景后的含藥血漿圖譜進(jìn)行蹄查和鑒定,發(fā)現(xiàn)了20種入血成分,根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,鑒定出了其中12個(gè)化學(xué)成分,并對(duì)4(3H)喹唑酮、色胺酮、異牡荊素、表告依春4個(gè)成分同標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì),進(jìn)一步確認(rèn)了化學(xué)結(jié)構(gòu)。(2)板藍(lán)根潛在藥效成分抑制神經(jīng)氨酸酶(NA)、血凝素(HA)的直接抗病毒作用研究。利用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)已從板藍(lán)根分離得到的化學(xué)成分進(jìn)行了全面篩選,得到28個(gè)對(duì)神經(jīng)氨酸酶可能有抑制活性的化學(xué)成分,3個(gè)對(duì)血凝素有抑制作用的化學(xué)成分,其中依靛藍(lán)酮、3-(2'羥苯基)-4(3H)-喹唑酮、3-(2'羧基苯基)-4(3H)-喹唑酮、色胺酮在板藍(lán)根水提液灌胃后的大鼠血漿中能夠檢測(cè)到。采用表面等離子體共振(SPR)技術(shù),成功篩選到了 13種化合物與NA蛋白有相互作用;篩選到靛藍(lán)與HA蛋白有相互作用,并得到了其相互作用的動(dòng)力學(xué)及親和力參數(shù)。采用以4-MUNANA為底物的熒光法,對(duì)前期通過(guò)分子對(duì)接和SPR篩選出的板藍(lán)根各潛在藥效成分,進(jìn)行了抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性驗(yàn)證,檢測(cè)結(jié)果表明,4(3H)-喹唑酮和甘草素具有較好的抑制活性,(+)-丁香樹脂醇、大黃素、靛藍(lán)、水楊酸、脫落酸、β-谷甾醇、3-醛基吲哚、吲哚-3-乙腈具有較弱的抑制活性;腺嘌呤、棕櫚酸、對(duì)羥基苯甲酸無(wú)抑制活性;通過(guò)紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)證實(shí)了靛藍(lán)具有抑制HA活性的作用。(3)板藍(lán)根潛在藥效成分對(duì)維甲酸誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)和Toll樣受體3(TLR3)介導(dǎo)的天然免疫信號(hào)通路調(diào)控作用的研究。通過(guò)PCR、ELISA、Western Blot等檢測(cè)方法研究了板藍(lán)根含藥血漿對(duì)RSV/ploy(I:C)感染后RAW264.7細(xì)胞中RIG-Ⅰ和TLR3介導(dǎo)的抗病毒天然免疫信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的影響,結(jié)果表明:當(dāng)細(xì)胞被病毒感染時(shí),細(xì)胞中RIG-Ⅰ和TLR3信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平都發(fā)生上調(diào),從而導(dǎo)致IFN-β的高表達(dá)。板藍(lán)根的抗病毒機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)病毒感染所誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ和TLR3信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的高表達(dá),從而下調(diào)IRF3的磷酸化,最終適度抑制病毒感染誘導(dǎo)的IFN-β的高表達(dá),使IFN-β的表達(dá)量維持在一個(gè)平衡點(diǎn),既能起到有效的抗病毒作用,又能減輕炎癥和組織損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284.1;R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2268180