發(fā)布時間：2018-05-25 00:00

  本文選題：精氨酸血管加壓素 + T型鈣電流��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:精氨酸血管加壓素(arginine vasopressin,AVP),是一種九肽神經(jīng)垂體激素,由下丘腦的視上核和室旁核分泌,目前已經(jīng)作為血管收縮劑用于心臟驟停急救及嚴重創(chuàng)傷休克后血管低反應(yīng)性的恢復(fù)中,由于AVP V2受體拮抗劑具有高選擇性,排水不排鈉,能夠增加自由水的排除而對電解質(zhì)沒有明顯影響,因此其已應(yīng)用于心衰引起的低鈉血癥治療中,另外AVP可以誘導(dǎo)V1a受體促進心肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化為分泌更強的肌成纖維細胞,引起心肌纖維化,多種研究證實了AVP可以調(diào)節(jié)L型離子通道,KCNQ鉀通道等導(dǎo)致心律失常作用。本實驗室既往研究已證明在急性和慢性作用時,AVP均可增加T型鈣電流,但是關(guān)于AVP對T型鈣通道作用機制尚未完全闡明。本研究使用全細胞膜片鉗技術(shù)從鈣敏感性調(diào)節(jié)分子PKC途徑入手研究其機制。主要內(nèi)容包括三部分:(1)進一步明確AVP對T型鈣電流的作用;(2)AVP調(diào)節(jié)T型鈣電流的作用與細胞內(nèi)鈣離子濃度的關(guān)系;(3)AVP通過鈣離子依賴性PKC信號傳導(dǎo)途徑增強T型鈣電流。方法:1制備和培養(yǎng)新生SD大鼠心室肌細胞實驗中使用1-3天內(nèi)的新生SD大鼠制備原代新生乳鼠心肌細胞,經(jīng)酶解法分離,將心肌細胞接種于35mm含10%牛血清的培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)皿中并置于37℃含5%CO2/95%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約12-24小時間后進行細胞電生理記錄。2全細胞模式電流記錄L型鈣離子電流和T型鈣電流使用全細胞模式記錄,室溫條件為(20℃-23℃),電極外液(mmol/L):氯化四乙銨(TEA)-Cl 136,Ca Cl22,Mg Cl2 2,HEPES 25,葡萄糖20,TEA-OH調(diào)節(jié)p H為7.3。根據(jù)Fabiato方程式電極內(nèi)液(mmol/L)設(shè)置為五種不同的鈣離子濃度:Cs Cl 130,Mg-ATP 2,HEPES 25,Cs-OH調(diào)節(jié)p H為7.3(鈣離子濃度如表1溶液A,B,C,D,和F)。玻璃微電極注入電極內(nèi)液后阻抗達4-6MΩ。L型+T型鈣電流的測定設(shè)計為:維持電位為-100m V,測試電位為-90m V至+50m V,階躍電壓10m V,步寬300ms。L型鈣電流的測定設(shè)計為:維持電位為-50m V,測試電位為-40m V至+50m V,階躍電壓10m V,步寬300ms。本研究采用同一細胞藥物刺激前后自身對照的方法,記錄300n M AVP對SD大鼠心肌細胞T型鈣通道的影響:(1)使用不同鈣離子濃度的電極內(nèi)液(p Ca=7 p Ca=8 p Ca=9 p Ca=10 p Ca=11)記錄未加入AVP時的鈣電流作為正常對照組,隨后加入300n M AVP,5分鐘后在次記錄鈣電流記錄作為實驗組。(2)本研究為進一步探討AVP對ICa.T的作用機制,使用蛋白激酶抑制劑(蛋白激酶A,PKA抑制劑、PKC抑制劑、蛋白激酶G,PKG抑制劑、鈣調(diào)蛋白II,Ca Mk II抑制劑、細胞外相關(guān)信號傳導(dǎo)激酶抑制劑)對細胞培養(yǎng)1小時后,在含有生理狀態(tài)的鈣離子濃度p Ca=7.2細胞外液中,記錄AVP作用前后T型鈣通道電流的變化。3數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)經(jīng)膜片鉗放大器(HEKA EPC 10,德國)采集,數(shù)據(jù)用mean±SE表示,相同鈣離子濃度實驗組采用t檢驗進行分析加藥前后兩組,不同鈣離子濃度實驗組使用多因素試驗資料的方差分析,P0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1 AVP能夠增加T型鈣電流這一作用受細胞內(nèi)鈣離子濃度調(diào)節(jié)。當(dāng)p Ca=11時,300n M AVP實驗組和正常對照組相比。T型鈣電流增加幅度為(9.63±0.83)%(n=12,P0.05~0.01);當(dāng)p Ca=10時,300n M AVP實驗組和正常對照組相比,T型鈣電流增加幅度為(27.83±2.43)%(n=12,P0.01);當(dāng)p Ca=9時,300n M AVP實驗組和正常對照組相比,T型鈣電流增加幅度為(33.28±4.90)%(n=13,P=0.001);當(dāng)p Ca=8時,300n M AVP實驗組和正常對照組相比,T型鈣電流增加幅度為(37.30±3.36)%(n=10,P0.05);當(dāng)p Ca=7時,300n M AVP實驗組和正常對照組相比,T型鈣電流增加幅度為(39.75±4.41)%(n=12,P0.05~0.01)。由此可見當(dāng)細胞內(nèi)液鈣離子濃度為p Ca7時,T型鈣通道電流明顯增加,而當(dāng)細胞內(nèi)液鈣離子濃度為p Ca11時,T型鈣電流增加不明顯,當(dāng)對p Ca=7時和p Ca=11時AVP對T型鈣電流增加幅度進行統(tǒng)計學(xué)分析P=0.001這些數(shù)據(jù)表明隨著細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加AVP對心肌細胞T型鈣電流增強作用更加明顯。AVP對T型鈣電流調(diào)控作用依賴細胞內(nèi)液鈣離子濃度的變化。2 AVP可能通過鈣依賴性PKC信號傳導(dǎo)途徑增強T型鈣電流。為進一步探討AVP對ICa.T的作用機制,使用蛋白激酶抑制劑對細胞培養(yǎng)1小時后,在含有生理狀態(tài)的鈣離子濃度p Ca=7.2細胞外液中,記錄AVP作用前后T型鈣通道電流的變化。對照組為300n M AVP,p Ca=7.2,ICa.T增加38.67±8.74%;加入H-89(蛋白激酶A,PKA抑制劑10κmol/L),AVP作用下ICa.T增加36.06±7.18%;加入白屈菜赤堿(PKC抑制劑5κmol/L)AVP作用下ICa.T增加14.68±5.21%。加入KT5823(蛋白激酶G,PKG抑制劑1κmol/L),AVP作用下ICa.T增加37.87±6.36%。加入KN-62(鈣調(diào)蛋白II,Ca MKII抑制劑3κmol/L),AVP作用下ICa.T增加39.9±7.26%,加入PD 98059(細胞外相關(guān)信號傳導(dǎo)激酶抑制劑10κmol/L),AVP作用下ICa.T增加37.60±5.36%。分別用各抑制劑實驗組增長率與對照組比較,其中PKC抑制劑組P0.05。其他實驗組P值均大于0.05,此結(jié)果說明加入PKC抑制劑AVP對T型鈣電流的作用減弱具有統(tǒng)計學(xué)意義,即AVP可能通過V1a介導(dǎo)PKC信號傳導(dǎo)途徑增強T型鈣電流。結(jié)論:AVP通過激活鈣依賴性PKC信號傳導(dǎo)途徑增強T型鈣電流。
[Abstract]:AIM : To study the effect of AVP on calcium current in rats with acute and chronic effects . 130,Mg-A In this study , the effect of 300n M AVP on T - type calcium channel in myocardial cells of SD rats was studied by using the method of self - control before and after stimulation with the same cell drug : ( 1 ) The calcium current was recorded as normal control group with different calcium ion concentrations ( p Ca = 7 p Ca = 8 p Ca = 9 p Ca = 10 p Ca = 11 ) . Then 300n M AVP was added and the calcium current was recorded as experimental group after 5 minutes . ( 2 ) To investigate the effect of AVP on ICa . T , the changes of T - type calcium channel current before and after AVP were recorded by using protein kinase inhibitor ( protein kinase A , inhibitor of protein kinase , PKC inhibitor , protein kinase G , PKGs inhibitor , calcium tone protein II , Ca 2 inhibitor , extracellular signal transduction kinase inhibitor ) . The results showed that the increase of T - type calcium current was ( 33.28 鹵 4.90 ) % ( n = 12 , P = 0.001 ) . Compared with the control group , the increase of T - type calcium current was ( 39.75 鹵 4.41 ) % ( n = 12 , P 0.05 锝，

本文編號：1931146