本文選題：體細(xì)胞重編程 + miRNA��； 參考：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：一些病因復(fù)雜、治療困難的疾病如惡性腫瘤、阿爾茲海默癥、帕金森病、先天性遺傳缺陷等和各種組織器官損傷,運(yùn)用傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)手段通常難以達(dá)到理想的治療效果,再生醫(yī)學(xué)的產(chǎn)生解決了這一難題。隨著生命科學(xué)技術(shù)和治療理念的更新和發(fā)展,再生醫(yī)學(xué)已經(jīng)涵蓋了包括組織工程、細(xì)胞和細(xì)胞因子治療、基因治療等在內(nèi)的多個(gè)方面。在細(xì)胞移植治療中,針對(duì)不同的疾病需要選用不同的細(xì)胞種類,進(jìn)而制定不同的治療方案,因此細(xì)胞來(lái)源極其重要。體細(xì)胞重編程技術(shù)的產(chǎn)生解決了細(xì)胞來(lái)源的問題,其可以將體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槿魏我环N細(xì)胞。本課題創(chuàng)新性地以多糖修飾的磷酸鈣納米粒子載體包載miRNA質(zhì)粒介導(dǎo)體細(xì)胞重編程,將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells,HUCMSCs)誘導(dǎo)為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem Cells,iPS),以解決再生醫(yī)學(xué)中種子細(xì)胞的來(lái)源問題。全文主要由五個(gè)章節(jié)構(gòu)成:第一章綜述本章節(jié)主要對(duì)細(xì)胞重編程技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)介,其中比較高效的方法是外源因子誘導(dǎo)法,包括小分子誘導(dǎo)、miRNA誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)座子、多順反子質(zhì)粒和非病毒載體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染等。比較了病毒載體和非病毒載體在細(xì)胞重編程方面的應(yīng)用和優(yōu)缺點(diǎn)�？紤]到安全性和生物相容性,非病毒基因載體的優(yōu)勢(shì)開始體現(xiàn)出來(lái),來(lái)源廣泛的、以中藥多糖為代表的天然多糖優(yōu)點(diǎn)眾多,在非病毒基因載體材料的研究領(lǐng)域中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。三維體系能夠提高基因轉(zhuǎn)染效率,因此也被應(yīng)用到細(xì)胞重編程中。第二章中藥多糖的提取分離與純化及陽(yáng)離子化中藥多糖的制備與表征本章主要對(duì)丹參多糖進(jìn)行提取分離純化,經(jīng)過大孔樹脂、5%乙醇洗脫得到不含有蛋白和核酸、純度較高的丹參多糖SMP。高效液相色譜分析顯示SMP多糖只有一個(gè)單峰,SMP的分子量為11455 Da。用席夫堿法對(duì)SMP多糖進(jìn)行陽(yáng)離子化(乙二胺修飾);對(duì)陽(yáng)離子化多糖進(jìn)行元素分析,N含量為6.18%;傅立葉紅外光譜(FT-IR)顯示1630 cm-1處出現(xiàn)N-H彎曲振動(dòng)吸收峰,陽(yáng)離子化中藥多糖的Zeta電位為+7.29m V,凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)離子化多糖具有基因攜帶能力和對(duì)質(zhì)粒的保護(hù)作用。第三章miRNA中藥多糖混雜磷酸鈣納米粒的制備、表征及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率研究本章制備陽(yáng)離子化丹參多糖修飾包載miRNA質(zhì)粒的磷酸鈣混雜納米粒,并對(duì)混雜納米粒子進(jìn)行表征。CSMP-CPNPs-pmiR-302abcd和CSMP-CPNPspmiR302/367混雜納米粒子的Zeta電位分別為+6.54 m V和+5.88 m V,粒徑在200nm以內(nèi),透射電鏡顯示納米粒子呈球狀或類球狀。紅外光譜結(jié)果顯示,所制備的磷酸鈣納米粒中含有陽(yáng)離子化丹參多糖,表明陽(yáng)離子化丹參多糖成功鏈接/包載在納米粒子中。納米粒細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高。凝膠電泳結(jié)果顯示納米粒子能夠包載質(zhì)粒,細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制結(jié)果顯示miRNA混雜納米粒子在體細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞途徑和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑,內(nèi)涵體-溶酶體系統(tǒng)也對(duì)復(fù)合物的有效轉(zhuǎn)染發(fā)揮著重要作用。而巨胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑不參與混雜納米粒的攝取,細(xì)胞骨架微絲介導(dǎo)混雜納米粒的胞內(nèi)運(yùn)輸,但細(xì)胞骨架的抑制不利于混雜納米粒的轉(zhuǎn)染。當(dāng)多糖-磷酸鈣納米粒與miRNA質(zhì)粒的質(zhì)量比為160:1,細(xì)胞數(shù)2×106個(gè)/m L,轉(zhuǎn)染四次時(shí),轉(zhuǎn)染效果最好。第四章miRNA中藥多糖混雜磷酸鈣納米粒介導(dǎo)的體細(xì)胞重編程及其機(jī)理研究本章以miRNA混雜納米粒為載體,轉(zhuǎn)染HUCMSCs細(xì)胞,考察重編程效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,混雜納米粒轉(zhuǎn)染四次后,出現(xiàn)克隆團(tuán),所形成的克隆團(tuán)均具有形態(tài)小、核質(zhì)比高、集落致密、邊緣清晰的特點(diǎn),堿性磷酸酶染色結(jié)果為陽(yáng)性,免疫熒光和Western Blot表明iPS高表達(dá)Sox2、Oct4、SSEA3、Tra-1-81、Nanog等多能干細(xì)胞特異性標(biāo)志分子。iPS具有體內(nèi)外的三胚層誘導(dǎo)分化能力,在體外能夠誘導(dǎo)分化為外胚層的神經(jīng)細(xì)胞、中胚層的軟骨細(xì)胞、內(nèi)胚層的肝臟細(xì)胞;在體內(nèi)能夠形成三胚層的各種組織,包括外胚層的神經(jīng)、中胚層的脂肪和肌肉以及內(nèi)胚層的腺體。iPS具有全能性基因和三胚層分化基因,形成的擬胚體(EB)在體外不能長(zhǎng)時(shí)間維持其多能性和三胚層分化能力。對(duì)體細(xì)胞重編程的機(jī)制進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)miRNA通過抑制NR2F2基因表達(dá),靶向下調(diào)NR2F2的mRNA和蛋白水平,拮抗TGF-β2,抑制細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),進(jìn)而發(fā)生體細(xì)胞重編程;miRNA還可以直接抑制TGF-β2受體,下調(diào)smad2/3和psmad2/3的表達(dá),從而促進(jìn)體細(xì)胞的重編程。表明所制備的中藥多糖非病毒miRNA載體具有高生物相容性、高安全性和低致癌風(fēng)險(xiǎn),能夠?yàn)樯a(chǎn)可用于臨床的重編程細(xì)胞提供理想的途徑。第五章纖維蛋白支架中miRNA混雜納米粒子介導(dǎo)的體細(xì)胞重編程本章將纖維蛋白原和凝血酶按照一定比例制備適合細(xì)胞生長(zhǎng)的三維支架,用掃描電鏡進(jìn)行表征,篩選出最佳的纖維蛋白支架并用于三維體細(xì)胞重編程。制備方法簡(jiǎn)單,細(xì)胞重編程效率極大提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:選用50 mg/m L纖維蛋白原加10μL 100 U/m L凝血酶制備纖維蛋白膠,所制備的支架疏松多孔,孔徑在50-100μm之間,適合細(xì)胞生長(zhǎng)。纖維蛋白膠中的細(xì)胞比二維狀態(tài)下的細(xì)胞生長(zhǎng)更好,增殖更快。纖維蛋白支架中在2-4天左右出現(xiàn)克隆團(tuán),堿性磷酸酶染色結(jié)果陽(yáng)性。免疫熒光鑒定,克隆團(tuán)陽(yáng)性表達(dá)Nanog、Tra-1-81、SSEA3等iPS/ES細(xì)胞特異性蛋白。對(duì)克隆團(tuán)進(jìn)行石蠟包埋切片和HE染色、免疫組化鑒定,陽(yáng)性表達(dá)Sox2和Oct4,可以確定三維支架中所形成的克隆團(tuán)為iPS細(xì)胞。纖維蛋白支架的生物相容性好、孔徑合適,能夠?yàn)榧?xì)胞提供類似于體內(nèi)的三維環(huán)境,且重編程效率高,所需時(shí)間短,可能為體細(xì)胞重編程在臨床上的應(yīng)用提供一個(gè)新的、高效的策略。
[Abstract]:This paper introduces the application and the advantages and disadvantages of the traditional medicine technique , including small molecule induction , miRNA induction , transposon , polycistronic plasmid and non - viral vector mediated transient transfection . The results of gel electrophoresis show that the cationic polysaccharides have the capability of carrying genes and the protective effect on plasmids . In chapter 3 , the preparation , characterization and transduction efficiency of the hybrid nanoparticles are as follows : In the fifth chapter , we can provide a new and efficient method for cell reprogramming . The results show that the prepared traditional Chinese medicine polysaccharide non - viral miRNA vector has the advantages of high biocompatibility , high safety and low carcinogenic risk , and can be used for the cell growth . It is shown that the prepared traditional Chinese medicine polysaccharide non - viral miRNA vector has high biocompatibility , high safety and low carcinogenic risk . The method is simple in preparation method and high in cell reprogramming efficiency .

【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1869795