發(fā)布時(shí)間：2018-04-20 02:17

  本文選題：食品藥品安全 + 致病菌�。� 參考：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：隨著經(jīng)濟(jì)與科技的快速不斷進(jìn)步,食品藥品安全問(wèn)題也變得越來(lái)越多,近些年在我國(guó)各地的食品藥品微生物安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中就檢出幾十種致病菌,由于傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),操作繁雜,我們以用多重PCR技術(shù)改進(jìn)檢測(cè)方法達(dá)到高效快速食源性致病菌的目的。我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性良好的引物,這些致病菌的引物退火溫度都在55℃左右,擴(kuò)增條帶是呈現(xiàn)梯度,并且優(yōu)化了反應(yīng)體系和條件。多重PCR是基于核酸的方法,檢測(cè)目標(biāo)病原體中的特異性基因,能避免出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。我們根據(jù)目前常被監(jiān)測(cè)到的食源性致病菌,并選擇由吉林省食品藥品監(jiān)督管理局提供的菌株:金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、大腸埃氏菌、黑曲霉菌為檢測(cè)的目的菌株。首先是提取致病菌基因組,由于黑曲霉菌是真菌所以選擇的基因組提取試劑盒與細(xì)菌的不同,之后設(shè)計(jì)特異性引物,是把所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行兩兩配對(duì),并且設(shè)置陰性對(duì)照組,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)觀察瓊脂糖凝膠電泳圖,可以判斷該兩對(duì)引物能否交叉擴(kuò)增。然后是進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。最后以制備的模擬致病菌污染的牛奶樣品和模擬致病菌污染的牛奶對(duì)照組樣品為模板進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。我們從查到的七種致病菌的總共18個(gè)基因中,篩選并驗(yàn)證了七種致病菌的特異性基因分別是乙型副傷寒沙門氏菌為mgt C基因、大腸埃希氏菌為uid A基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、短小芽孢桿菌gyr B基因、枯草芽孢桿菌rpo A基因、銅綠假單胞菌Opr L基因、黑曲霉fum8基因。以這些為目的基因設(shè)計(jì)了特異性引物用軟件設(shè)計(jì)出了特異性較好的引物,長(zhǎng)度大小為:黑曲霉菌的引物長(zhǎng)度為665 bp、乙型副傷寒沙門氏菌的引物長(zhǎng)度為500 bp、短小芽孢桿菌的引物長(zhǎng)度為403 bp、枯草芽孢桿菌的因?yàn)殚L(zhǎng)度為349 bp、金黃色葡萄球菌的引物長(zhǎng)度為280 bp、大腸埃希氏菌的引物長(zhǎng)度為210 bp、銅綠假單胞菌的引物長(zhǎng)度105 bp。然后優(yōu)化了較好的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系,而且有較高的穩(wěn)定性,其檢測(cè)限可以達(dá)到1.2 CFU/m L,較目前開發(fā)的Ge XP-PCR技術(shù)檢測(cè)六種致病菌的檢測(cè)限分別為420,310,270,93,85和66 CFU/m L等提高了至少50-350倍,并且多重PCR檢測(cè)方法較其他基于生物傳感器和免疫學(xué)的檢測(cè)方法具有成本低,穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)仍然可以不斷增加同時(shí)檢測(cè)的菌株數(shù)目。我們?cè)谟枚嘀豍CR檢驗(yàn)牛奶樣品的初步應(yīng)用時(shí),其中除大腸桿菌的其他6種致病菌的檢測(cè)限可以達(dá)到102 CFU/m L,并且有5種種致病菌的檢測(cè)限可達(dá)10 CFU/m L,但是也發(fā)現(xiàn)大腸桿菌只能在104 CFU/m L的活菌數(shù)濃度才能擴(kuò)增出目的條帶,可能的原因:1)在第二章中提到了進(jìn)行多重PCR反應(yīng)應(yīng)該要對(duì)增加反應(yīng)體系中Mix的量以及反應(yīng)條件的循環(huán)數(shù)等,所以本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)之處就是在以牛奶為模板時(shí)可以根據(jù)檢測(cè)的菌種數(shù)調(diào)整反應(yīng)體系和條件,一般的,檢測(cè)目的菌種數(shù)目越多,循環(huán)數(shù)越多,Mix用量也越多,并且以后再以其他類樣品如肉類,豆制品等食品為模板時(shí)也應(yīng)適當(dāng)增加Mix的量或者循環(huán)數(shù)等;2)同樣也可能是大腸桿菌的引物對(duì)的Tm值為58.7℃和62.9℃,較其他引物對(duì)高,而這也是由于反應(yīng)條件沒(méi)進(jìn)行調(diào)整造成的,所以在檢測(cè)不同食品的應(yīng)用中都要調(diào)整反應(yīng)條件。我們也檢測(cè)了吉林大學(xué)藥學(xué)院贈(zèng)予的無(wú)菌眼藥水,并且以無(wú)菌水為陰性對(duì)照組,結(jié)果為該眼藥水是無(wú)致病的,并且檢測(cè)的時(shí)間為4 h,因此我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中建立的方法為較傳統(tǒng)方法數(shù)3-7d的檢測(cè)時(shí)間快。
[Abstract]:With the rapid and continuous progress of economy and science and technology, the problem of food and drug safety has become more and more. In recent years, dozens of pathogenic bacteria have been detected in the monitoring of the safety risk of food and drug microorganisms in all parts of our country. Because of the long time consuming and complicated operation, we use multiple PCR technology to improve the detection method to achieve high efficiency. The aim of rapid foodborne pathogenic bacteria. We designed specific primers. The primers of these pathogens were annealed at about 55 degrees centigrade. The amplified bands were gradient, and the reaction system and conditions were optimized. Multiple PCR is a nucleic acid based method to detect specific genes in the target pathogen and avoid false positive. Results. We are based on the food borne pathogens that are currently monitored and selected by the strains provided by the food and Drug Administration of Jilin Province: Staphylococcus aureus, paratyphoid salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Escherichia coli and Aspergillus niger. The genome of the pathogenic bacteria was taken from the genomic Extraction Kit selected by Aspergillus niger, and then the specific primers were designed. 22 pairs of primers were designed and the negative control group was set up and then amplified by PCR. By observing the agar gel electrophoresis, the two pairs of primers could be judged if the primers could be primed. Multiple PCR reactions were then carried out. In the end, milk samples contaminated by the simulated pathogenic bacteria and the milk control group samples contaminated with simulated pathogenic bacteria were used for multiple PCR responses. We screened and verified that the specific genes of the seven pathogenic bacteria were respectively B from the seven species of pathogenic bacteria found. Salmonella paratyphoid is Mgt C, Escherichia coli is UID A, Staphylococcus aureus NUC, Bacillus subtilis Gyr B, Bacillus subtilis RPO A, Opr L of Pseudomonas aeruginosa, and Aspergillus niger fum8 genes. The specific primers designed by these specific primers are better. Primer length is: the length of primers of Aspergillus niger is 665 BP, primer length of Salmonella paratyphi is 500 BP, the length of primers of Bacillus subtilis is 403 BP, the length of Bacillus subtilis is 349 BP, the length of primer of Staphylococcus aureus is 280 BP, the length of primer of Escherichia coli is 210 BP, and the Pseudomonas aeruginosa is Pseudomonas aeruginosa. The primer length of monomonas aeruginosa was 105 bp., and the better reaction condition and reaction system were optimized, and the detection limit could reach 1.2 CFU/m L. The detection limit of six pathogenic bacteria detected by Ge XP-PCR technology is at least 50-350 times higher than that of 420310270,93,85 and 66 CFU/m L, respectively. Compared with other methods based on biosensor and immunology, the method has the advantages of low cost, good stability and so on. At the same time, we can continue to increase the number of strains detected at the same time. In the preliminary application of multiple PCR test milk samples, the detection limit of 6 kinds of pathogenic bacteria except Escherichia coli can reach 102 CFU/m L, And the detection limit of 5 pathogenic bacteria can be up to 10 CFU/m L, but it is also found that Escherichia coli can only amplify the target bands at 104 CFU/m L. Possible reasons: 1) in the second chapter, multiple PCR reactions should be added to the amount of Mix in the reaction system and the cycle number of the reaction conditions. The improvement of the test is that when milk is used as a template, the reaction system and conditions can be adjusted according to the number of tested bacteria. In general, the more the number of bacteria species, the more circulation, the more Mix is used, and in the future, the amount of Mix or the number of cycles should be appropriately increased with other samples such as meat, bean products and so on; 2 It is also possible that the Tm value of the primers of Escherichia coli is 58.7 and 62.9, higher than the other primers, and this is because the reaction conditions are not adjusted, so the reaction conditions should be adjusted in the application of different foods. We also tested the aseptic eyedrops given by the Jilin University College of pharmacy and used aseptic water as a result. In the negative control group, the result was that the eye drops were not pathogenic, and the time of detection was 4 h, so the method we established in this experiment was faster than the traditional method of 3-7d.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R155;R440

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本文編號(hào)：1775797