本文選題：肝纖維化 + 肝星狀細(xì)胞　； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是一種由多種致肝損傷的因子(例如:HBV或HCV感染、酒精濫用、高脂飲食等)引起的損傷修復(fù)反應(yīng)。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),抑制肝星狀細(xì)胞的活化及增殖是肝纖維治療的主要策略之一。Wnt/β-catenin通路的激活不僅是肝星狀細(xì)胞活化的重要標(biāo)志,并且能夠顯著地促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和增殖�？缒さ鞍�88(Transmembrane protein 88,Tmem88)是一種雙跨膜的蛋白,在人心肌細(xì)胞以及非洲爪蟾的胚胎細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)其能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化。Tmem88能否通過阻礙Wnt/β-catenin通路的活化來抑制肝星狀細(xì)胞的活化與增殖,從而阻礙肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,還未見文獻(xiàn)報(bào)道。為研究Tmem88在肝纖維化進(jìn)程中的作用,課題組檢測(cè)Tmem88在人肝纖維化組織、小鼠原代肝星狀細(xì)胞以及活化的HSC-T6細(xì)胞中的表達(dá)變化;通過分別過表達(dá)和沉默HSC-T6細(xì)胞中的Tmem88,檢測(cè)Tmem88對(duì)于肝星狀細(xì)胞的活化、增殖及凋亡的影響;通過檢測(cè)Tmem88基因的甲基化狀態(tài),探討其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,并進(jìn)一步探究了3種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶對(duì)其表達(dá)的調(diào)控作用。本文主要研究?jī)?nèi)容包括下面4個(gè)部分:1.Tmem88在人肝纖維化組織、小鼠原代肝星狀細(xì)胞以及活化的HSC-T6細(xì)胞中的表達(dá)變化臨床標(biāo)本:從臨床收集新鮮的人肝癌組織,HE和Masson染色觀察肝臟病理改變,根據(jù)病理分級(jí),將肝組織分為對(duì)照組(Control)和纖維化組(Fibrosis)。分別提取肝纖維化組織以及對(duì)照組肝組織,應(yīng)用Western Blot、免疫組化技術(shù)檢測(cè)Tmem88的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:Tmem88在人肝纖維組織中的表達(dá)顯著降低。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):將24只C57BL/6小鼠(雄性,20~22g)隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)和肝纖維化模型組(CCL4),每組12只。模型組小鼠背部皮下注射20%CCL4橄欖油溶液,每周2次,持續(xù)4周;對(duì)照組給予相同劑量的橄欖油溶液。停止注射CCL4后的第二天分別處死對(duì)照組和模型組中的小鼠,收集血清、肝臟標(biāo)本以及原代的肝星狀細(xì)胞待用。HE染色和Masson染色觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的病理變化,生化指標(biāo)檢測(cè)血清ALT和AST水平。免疫熒光雙染、免疫組化、QPCR以及Western Blot檢測(cè)Tmem88的定位和表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)小鼠肝纖維化模型建立成功;(2)Tmem88主要表達(dá)于小鼠的肝星狀細(xì)胞中;(3)Tmem88在肝纖維化小鼠的原代肝星狀細(xì)胞中表達(dá)下降。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):HSC-T6細(xì)胞經(jīng)10ng/ml的TGF-β1刺激活化24h后,分別采用QPCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)Tmem88在活化的HSC中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示:Tmem88在TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞中表達(dá)顯著降低。2.過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化、增殖以及凋亡的影響應(yīng)用QPCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中活化標(biāo)志蛋白(Col1α1和α-SMA)的表達(dá)變化,明確過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化的影響;其次運(yùn)用MTT檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞的細(xì)胞活力變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布,明確過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響;應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞中的Wnt/β-catenin活化的影響;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的分布,Western Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中凋亡相關(guān)蛋白(Caspase3、Bcl-2和Bax)的表達(dá)變化,明確過表達(dá)Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):過表達(dá)Tmem88可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化,通過阻礙Wnt/β-catenin通路活化能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6的增殖并使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,并且能夠促進(jìn)活化的HSC-T6細(xì)胞的凋亡。3.沉默Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化、增殖以及凋亡的影響應(yīng)用QPCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中活化標(biāo)志蛋白(Col1α1和α-SMA)的表達(dá)變化,明確沉默Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞活化的影響;應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)沉默Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞中的Wnt/β-catenin通路活化的影響;應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中凋亡相關(guān)蛋白(Caspase3、Bcl-2和Bax)的表達(dá)變化,明確沉默Tmem88對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):沉默Tmem88可以促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化,強(qiáng)化Wnt/β-catenin通路的活化,并且能夠抑制活化的HSC-T6細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。4.DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶對(duì)Tmem88表達(dá)的影響RRBS篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tmem88基因的甲基化程度在肝纖維化小鼠的原代肝星狀細(xì)胞中是正常對(duì)照小鼠的158倍。在卵巢癌的研究中也發(fā)現(xiàn)Tmem88的蛋白表達(dá)與其基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)相關(guān)。課題組進(jìn)一步觀察了Tmem88的甲基化調(diào)控機(jī)制。課題組應(yīng)用了DNA甲基化抑制劑5-Azad C(2umol/L)處理TGF-β1誘導(dǎo)活化的HSC-T6細(xì)胞,應(yīng)用Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)Tmem88以及活化標(biāo)志蛋白(Col1α1和α-SMA)的表達(dá)變化;提取小鼠原代肝星狀細(xì)胞以及活化的HSC-T6細(xì)胞中的蛋白,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b)的表達(dá)變化;分別沉默HSC-T6細(xì)胞中的三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶經(jīng)TGF-β1活化后,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中Tmem88的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)5-Azad C能夠恢復(fù)Tmem88在活化的HSC-T6細(xì)胞中的表達(dá);(2)Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的蛋白水平在肝纖維化小鼠的原代肝星狀細(xì)胞以及活化的HSC-T6中均顯著升高;(3)沉默Dnmt3a能夠恢復(fù)Tmem88在活化的HSC-T6中的蛋白表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1758899