本文選題：血管新生 + 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞��； 參考：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景:血管新生,是指從已有的血管形成新的血管的過(guò)程,在胚胎發(fā)育和組織再生中都是一個(gè)至關(guān)重要的過(guò)程,此外,血管新生也與多種疾病相關(guān),如腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。血管新生涉及多種細(xì)胞的多個(gè)過(guò)程,內(nèi)皮細(xì)胞的變化是最主要的,而且貫穿始終。主要是內(nèi)皮細(xì)胞接受缺氧細(xì)胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等物質(zhì)傳遞來(lái)的信號(hào)后被活化從而導(dǎo)致了血管新生。血管新生過(guò)程需要一個(gè)唯一的特化形成的頂細(xì)胞,通過(guò)延伸出的動(dòng)態(tài)偽足來(lái)探索周圍的環(huán)境,引導(dǎo)血管新生的方向,而相鄰的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間的相互信號(hào)成為柄細(xì)胞,跟隨其后增殖,形成管腔。隨后相鄰的出芽形成的血管相互熔斷,連接,覆蓋周細(xì)胞并灌注形成成熟的血管。VEGF和NOTCH通路形成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路在頂-柄細(xì)胞的選擇和維持中發(fā)揮了重要的作用。本課題組前期通過(guò)分析內(nèi)皮頂細(xì)胞/柄細(xì)胞芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),SOX2在這兩種表型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中均處在關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置,這提示我們SOX2可能在血管新生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前期實(shí)驗(yàn)中選擇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)為研究對(duì)象,因其可代表人體內(nèi)絕大多數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝和對(duì)外界生理、毒理反應(yīng)的特征,被許多研究者作為內(nèi)皮細(xì)胞模型。前期實(shí)驗(yàn)證明了在HUVEC中過(guò)表達(dá)SOX2能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力,我們期望進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)錄因子SOX2促進(jìn)增殖的分子機(jī)制,以豐富對(duì)血管新生機(jī)制的研究。方法:pcDNA3.0-SOX2質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HUVEC,并利用G418藥物進(jìn)行穩(wěn)定篩選,后用有限稀釋法獲取單克隆,構(gòu)建過(guò)表達(dá)SOX2的HUVEC。利用qPCR檢測(cè)SOX2的轉(zhuǎn)錄水平,利用Western blot檢測(cè)SOX2的蛋白表達(dá)水平。之后利用qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NOTCH和VEGF通路中相關(guān)配體和受體分子的表達(dá)變化,初步篩選出差異表達(dá)的基因,Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證和篩選。之后對(duì)選出的分子進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP),Ch IP是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法,驗(yàn)證是否是SOX2的直接靶基因。隨后對(duì)選定的靶基因在過(guò)表達(dá)SOX2細(xì)胞中進(jìn)行沉默,并用CCK8法、Ed U法、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定增殖能力。結(jié)果:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-SOX2質(zhì)粒,并利用G418藥物進(jìn)行穩(wěn)定篩選,后用有限稀釋法獲取7株單克隆(后文用SOX2-n表示,n=1~7),轉(zhuǎn)染空載組后文以EV(Empty vector)表示。經(jīng)過(guò)qPCR鑒定,對(duì)比EV組和SOX2~+HUVEC組,其中4株有不同程度的高表達(dá),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),選其中2株表達(dá)最高的細(xì)胞利用Western blot檢測(cè)SOX2表達(dá)水平,SOX2-1、SOX2-2比EV組表達(dá)水平顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,P0.01)(后文用SOX2-1,SOX2-2表示),進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用qPCR,檢測(cè)SOX2-1,SOX2-2中VEGF通路受體和配體的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,在SOX2-1中,NRP1表達(dá)降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),VEGFA,VEGFR1-3無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在SOX2-2中,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。利用qPCR,檢測(cè)SOX2-1,SOX2-2中NOTCH通路受體和配體的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,在SOX2-1中DLL4表達(dá)降低,JAGGED1表達(dá)升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),DLL1,DLL3,JAGGED2,NOTCH1,NOTCH2,NOTCH3,NOTCH4無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在SOX2-2中,JAGGED1表達(dá)升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),DLL4,JAGGED2,NOTCH1,NOTCH2,NOTCH3,NOTCH4無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。利用Western blot,檢測(cè)SOX2-1,SOX2-2中差異基因DLL4,NRP1,JAGGED1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,JAGGED1表達(dá)高于EV組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,P0.01),DLL4表達(dá)低于EV組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),NRP1在SOX2-2中表達(dá)升高(P0.05),在SOX2-1中表達(dá)與EV組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。查閱文獻(xiàn),獲取三個(gè)基因與SOX2可能的結(jié)合信息,并未發(fā)現(xiàn)DLL4與SOX2相關(guān)的研究。因此通過(guò)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)獲得NRP1,DLL4,JAGGED1的啟動(dòng)子區(qū)序列,并利用The Jaspar Database進(jìn)行SOX2結(jié)合位點(diǎn)的在線預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,JAGGED1有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn),NRP1有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),而DLL4沒(méi)有找到可能的結(jié)合位點(diǎn),因此DLL4不做Ch IP-qPCR驗(yàn)證。利用Ch IP-qPCR驗(yàn)證SOX2對(duì)NRP1,JAGGED1的直接結(jié)合性,結(jié)果顯示,SOX2組比陰性對(duì)照Ig G組富集了更多的JAGGED1啟動(dòng)子區(qū)片段,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),NRP1沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明SOX2蛋白能夠直接結(jié)合JAGGED1的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)揮上調(diào)作用。前期研究證明了在HUVEC中過(guò)表達(dá)SOX2能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,我們想知道是否是通過(guò)JAGGED1發(fā)揮作用的。用三個(gè)慢病毒sh RNA-JAGGED1序列感染過(guò)表達(dá)細(xì)胞系SOX2-1,沉默JAGGED1,對(duì)照組為SOX2~+/Scrambled sh RNA(下文簡(jiǎn)寫(xiě)為SOX2~+/Scr sh RNA)。感染72h觀察對(duì)照組和沉默組熒光,計(jì)數(shù)有熒光的細(xì)胞達(dá)到80%-90%。隨后,利用qPCR和Western blot檢測(cè)JAGGED1沉默效果,三個(gè)沉默組均出現(xiàn)了不同程度的降低,而三號(hào)序列沉默效果最強(qiáng),因此使用三號(hào)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果表明,SOX2~+/JAGGED1-組的細(xì)胞增殖能力比SOX2~+/Scr sh RNA組低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第2天P0.05,第3-7天P0.001)。通過(guò)計(jì)算得到細(xì)胞的群體倍增時(shí)間(population doubling time,PDT),SOX2~+/JAGGED1-組比對(duì)照組更長(zhǎng)(P0.05)。Ed U法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力,對(duì)照組處于增殖期的細(xì)胞比例高于對(duì)照組(P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期并計(jì)算細(xì)胞的增殖比例,也得到了類似的結(jié)果(P0.05)。在過(guò)表達(dá)SOX2的情況下,沉默JAGGED1,可以抵消部分SOX2過(guò)表達(dá)造成的增殖能力升高。這說(shuō)明,在HUVEC中,轉(zhuǎn)錄因子SOX2至少部分通過(guò)上調(diào)其直接靶基因JAGGED1促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)論:在HUVEC中,SOX2可以通過(guò)直接結(jié)合NOTCH通路配體JAGGED1啟動(dòng)子區(qū)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并上調(diào)JAGGED1的表達(dá)。沉默JAGGED1可以部分阻斷SOX2促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 任敏;轉(zhuǎn)錄因子SOX2對(duì)體外血管生成能力的影響[D];吉林大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1732416