本文選題：血管新生 + 人臍靜脈內(nèi)皮細胞��； 參考：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景:血管新生,是指從已有的血管形成新的血管的過程,在胚胎發(fā)育和組織再生中都是一個至關(guān)重要的過程,此外,血管新生也與多種疾病相關(guān),如腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。血管新生涉及多種細胞的多個過程,內(nèi)皮細胞的變化是最主要的,而且貫穿始終。主要是內(nèi)皮細胞接受缺氧細胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等物質(zhì)傳遞來的信號后被活化從而導(dǎo)致了血管新生。血管新生過程需要一個唯一的特化形成的頂細胞,通過延伸出的動態(tài)偽足來探索周圍的環(huán)境,引導(dǎo)血管新生的方向,而相鄰的細胞通過細胞間的相互信號成為柄細胞,跟隨其后增殖,形成管腔。隨后相鄰的出芽形成的血管相互熔斷,連接,覆蓋周細胞并灌注形成成熟的血管。VEGF和NOTCH通路形成的負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路在頂-柄細胞的選擇和維持中發(fā)揮了重要的作用。本課題組前期通過分析內(nèi)皮頂細胞/柄細胞芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),SOX2在這兩種表型細胞轉(zhuǎn)錄中均處在關(guān)鍵節(jié)點位置,這提示我們SOX2可能在血管新生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前期實驗中選擇人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)為研究對象,因其可代表人體內(nèi)絕大多數(shù)血管內(nèi)皮細胞代謝和對外界生理、毒理反應(yīng)的特征,被許多研究者作為內(nèi)皮細胞模型。前期實驗證明了在HUVEC中過表達SOX2能夠促進內(nèi)皮細胞的增殖能力,我們期望進一步明確轉(zhuǎn)錄因子SOX2促進增殖的分子機制,以豐富對血管新生機制的研究。方法:pcDNA3.0-SOX2質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HUVEC,并利用G418藥物進行穩(wěn)定篩選,后用有限稀釋法獲取單克隆,構(gòu)建過表達SOX2的HUVEC。利用qPCR檢測SOX2的轉(zhuǎn)錄水平,利用Western blot檢測SOX2的蛋白表達水平。之后利用qPCR檢測轉(zhuǎn)染后NOTCH和VEGF通路中相關(guān)配體和受體分子的表達變化,初步篩選出差異表達的基因,Western blot進一步驗證和篩選。之后對選出的分子進行染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP),Ch IP是研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法,驗證是否是SOX2的直接靶基因。隨后對選定的靶基因在過表達SOX2細胞中進行沉默,并用CCK8法、Ed U法、流式細胞術(shù)測定增殖能力。結(jié)果:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-SOX2質(zhì)粒,并利用G418藥物進行穩(wěn)定篩選,后用有限稀釋法獲取7株單克隆(后文用SOX2-n表示,n=1~7),轉(zhuǎn)染空載組后文以EV(Empty vector)表示。經(jīng)過qPCR鑒定,對比EV組和SOX2~+HUVEC組,其中4株有不同程度的高表達,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),選其中2株表達最高的細胞利用Western blot檢測SOX2表達水平,SOX2-1、SOX2-2比EV組表達水平顯著升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001,P0.01)(后文用SOX2-1,SOX2-2表示),進行后續(xù)實驗。利用qPCR,檢測SOX2-1,SOX2-2中VEGF通路受體和配體的表達變化。結(jié)果顯示,在SOX2-1中,NRP1表達降低,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),VEGFA,VEGFR1-3無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。在SOX2-2中,均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。利用qPCR,檢測SOX2-1,SOX2-2中NOTCH通路受體和配體的表達變化。結(jié)果顯示,在SOX2-1中DLL4表達降低,JAGGED1表達升高,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),DLL1,DLL3,JAGGED2,NOTCH1,NOTCH2,NOTCH3,NOTCH4無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。在SOX2-2中,JAGGED1表達升高,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),DLL4,JAGGED2,NOTCH1,NOTCH2,NOTCH3,NOTCH4無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。利用Western blot,檢測SOX2-1,SOX2-2中差異基因DLL4,NRP1,JAGGED1的蛋白表達水平。結(jié)果顯示,JAGGED1表達高于EV組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05,P0.01),DLL4表達低于EV組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),NRP1在SOX2-2中表達升高(P0.05),在SOX2-1中表達與EV組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。查閱文獻,獲取三個基因與SOX2可能的結(jié)合信息,并未發(fā)現(xiàn)DLL4與SOX2相關(guān)的研究。因此通過Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得NRP1,DLL4,JAGGED1的啟動子區(qū)序列,并利用The Jaspar Database進行SOX2結(jié)合位點的在線預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示,JAGGED1有一個結(jié)合位點,NRP1有兩個結(jié)合位點,而DLL4沒有找到可能的結(jié)合位點,因此DLL4不做Ch IP-qPCR驗證。利用Ch IP-qPCR驗證SOX2對NRP1,JAGGED1的直接結(jié)合性,結(jié)果顯示,SOX2組比陰性對照Ig G組富集了更多的JAGGED1啟動子區(qū)片段,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),NRP1沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果說明SOX2蛋白能夠直接結(jié)合JAGGED1的啟動子區(qū)發(fā)揮上調(diào)作用。前期研究證明了在HUVEC中過表達SOX2能夠促進內(nèi)皮細胞的增殖,我們想知道是否是通過JAGGED1發(fā)揮作用的。用三個慢病毒sh RNA-JAGGED1序列感染過表達細胞系SOX2-1,沉默JAGGED1,對照組為SOX2~+/Scrambled sh RNA(下文簡寫為SOX2~+/Scr sh RNA)。感染72h觀察對照組和沉默組熒光,計數(shù)有熒光的細胞達到80%-90%。隨后,利用qPCR和Western blot檢測JAGGED1沉默效果,三個沉默組均出現(xiàn)了不同程度的降低,而三號序列沉默效果最強,因此使用三號細胞進行后續(xù)實驗。用CCK8法檢測細胞的增殖能力。結(jié)果表明,SOX2~+/JAGGED1-組的細胞增殖能力比SOX2~+/Scr sh RNA組低,有統(tǒng)計學(xué)意義(第2天P0.05,第3-7天P0.001)。通過計算得到細胞的群體倍增時間(population doubling time,PDT),SOX2~+/JAGGED1-組比對照組更長(P0.05)。Ed U法檢測細胞的增殖能力,對照組處于增殖期的細胞比例高于對照組(P0.01)。流式細胞術(shù)檢測細胞周期并計算細胞的增殖比例,也得到了類似的結(jié)果(P0.05)。在過表達SOX2的情況下,沉默JAGGED1,可以抵消部分SOX2過表達造成的增殖能力升高。這說明,在HUVEC中,轉(zhuǎn)錄因子SOX2至少部分通過上調(diào)其直接靶基因JAGGED1促進細胞增殖。結(jié)論:在HUVEC中,SOX2可以通過直接結(jié)合NOTCH通路配體JAGGED1啟動子區(qū)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,并上調(diào)JAGGED1的表達。沉默JAGGED1可以部分阻斷SOX2促進細胞增殖的作用。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 任敏;轉(zhuǎn)錄因子SOX2對體外血管生成能力的影響[D];吉林大學(xué);2016年

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本文編號：1732416