本文選題：ZIP8　切入點：丙型肝炎病毒　出處：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景:丙型肝炎病毒(HCV)感染被認為是慢性肝炎的主要原因。慢性丙型肝炎患者首先發(fā)展為慢性性炎癥,導致肝硬化(20-40%),隨后(4-6%的患者)發(fā)展成肝細胞癌(感染后的10-40年)。目彰肝細胞癌的發(fā)病機制尚不明確,其與HCV相關性仍然存在爭議,研究表明HCV蛋白可加強致癌轉化。HCV-RNA基因編碼多聚蛋白前體,可經(jīng)病毒自身蛋白酶和宿主細胞作用后生成病毒體結構蛋白(核心蛋白和糖蛋白E1和E2)和非結結構(NS)蛋白(p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B)。在體內(nèi)HCV核心蛋白(HCVcore)可通過各種信號途徑來介導免疫反應,促使炎癥的發(fā)生。鋅轉運蛋白通過調節(jié)鋅離子流入,流出和分布到細胞器中,來維持細胞內(nèi)的鋅穩(wěn)態(tài),包括免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。鋅轉運蛋白包括兩個蛋白家族:ZIPs(SLC39)和ZnTs(SLC30)。ZIPs轉運蛋白使細胞質內(nèi)鋅離子含量升高,ZnTs轉運蛋白使細胞質內(nèi)鋅離子含量降低,SLC39A8基因編碼的ZIP8屬于ZIPs蛋Qg白族。Begum等人研究發(fā)現(xiàn)在人類免疫刺激的單核細胞和分化的巨噬細胞中,ZIP8轉運蛋白高水平表達。在Z1P8轉染的細胞中,ZIP8主要定位于溶酶體上。研究顯示,鋅離子以ZIP8依賴的方式調節(jié)人體巨噬細胞中LPS介導的免疫反應,ZIP8敲除后會抑制在LPS驅動下的細胞內(nèi)鋅離子的積累,并使IL-10在mRNA水平上的表達升高。ZIP8通過調控Zn2+參與骨關節(jié)炎的發(fā)病機制。此外,ZIP8可通過NF-κB信號途徑來負反饋調節(jié)促炎反應。鈣調神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin,CaN)屬于蛋白磷酸酶2B家族,依賴于Ca2+/鈣調素(CaM)調節(jié),分布于許多哺乳動物器官。前期研究發(fā)現(xiàn),在體外LPS刺激下CaN可以通過NF-κB信號途徑來調節(jié)炎癥因子的釋放,如:IL-2,NO。在CaN催化結構域中,二價金屬離子如:Zn2+和Fe2+為必要元素,并且在體外可被Mn2+和Ni2+激活。研究目的:檢測正常人,丙肝患者和治愈后丙肝患者外周血單個核細胞(PBMCs)中ZIP8 mRNA的表達情況,探討慢性丙型肝炎與ZIP8的關系。通過ZIP8過表達、RNA干擾和缺鋅、加鋅處理HepG2細胞來探討HepG2細胞對HCV core免疫應答過程中ZIP8的作用。實驗方法:1.臨床標本收集正常人(n=28),丙型肝炎患者(n=39),治愈后丙型肝炎患者(n=49)血液標本,用qRT-PCR方法來檢測ZIP8 mRNA的表達。2.HCV core對HepG2細胞ZIP8表達的影響培養(yǎng)HepG2細胞,脂質體轉染pcDNA3.1、pcDNA3.1-HCV core質粒,24h后收集細胞,用qRT-PCR和Western blot方法檢測ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表達。3.ZIP8在HCV core免疫應成答過程中的作用(1)ZIP8、HCV core表達載體共轉染HepG2細胞,設為三組:Vector、HCVc和HCVc+ZIP8,轉染24h后,收集細胞。(2)ZIP8RNA干擾轉染HepG2細胞,48h后,轉染HCVcore表達質粒,分為三組:Vector+NCsi、,HCVc+NCsi 和 HCVc+ZIP8si,繼續(xù)培養(yǎng) 24h 后,收集細胞。4.ZIP8通過調控Zn2+在HCVcore免疫應答過程中的作用(1)用 2.5μM TPEN、50μM ZnCl2 預處理 HepG2 細胞 lh,然后轉染 HCV core 表達載體,設為四組:Vector、HCVc、HCVc+ZrnCl2 和 HCVc+TPEN,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,收集細胞(2)ZIP8 RNA 干擾轉染 HepG2 細胞,48h 后,用 50μM ZnCl2預處理 HepG2細胞lh,然后轉染HCV core表達載體,設為四組:Vector+NCsi、HCVc+NCsi、HCVc+ZIP8si 和 HCVc+ZIP8si+ZnCl2,繼續(xù)培養(yǎng) 24h 后,收集細胞。以上收集的細胞用于提取RNA,細胞內(nèi)蛋白,胞內(nèi)核蛋白,進一步用qRT-PCR檢測NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表達。用Western blot檢測IKKβ、p-IKKβ以及核蛋白p-NF-KBp65在蛋白水平上的表達。5.ZIP8和Zn2+對CaN活性的影響提取各組細胞內(nèi)蛋白,用CaN試劑盒檢測各組CaN活性。6.細胞內(nèi)鋅含量的測定用鋅離子熒光探針來檢測 HCVc、HCVc+ZIP8、HCVc+ZrnCl2、HCVc+TPEN、HCVc+ZlP8si和HCVc+ZIP8si+ ZnCI2,這六組實驗組組中細胞內(nèi)鋅離子含量。實驗結果:1.臨床標本與正常對照組相比,ZIP8 mRNA表達水平征在丙型肝炎患者中顯著降低;在治愈后丙肝患者中無明顯差異。與丙肝患者相比,ZIP8 mRNA在治愈后的丙肝患者中表達顯著升高。2.HCV core 上調 HepG2 細胞 ZIP8 的表達與對照組相比,HCV core能夠顯著增加ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表達。3.ZIP8在HCV core免疫應答過程中的作用qRT-PCR結果顯示:ZIP8過表達能夠顯著降低NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-αa在mRNA水平上的表達;ZIP8RNA干擾能夠顯著升高NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表達。Western blot結果顯示:ZIP8過表達能夠顯著降低IKKβ、p-IKKβ和核內(nèi)p-NF-KBp65在蛋白水平上的表達。ZIP8 RNA干擾能夠顯著升高IKKβ、p-IKKp和核內(nèi)P-NF-κBP65在蛋白水平上的表達。4.ZIP8通過調控Zn2+在HCV core免疫應答過程中的作用qRT-PCR結果顯示:50μMZnCl2加鋅處理能夠使NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達水平顯著降低;2.5μM TPEN缺鋅處理能夠使NF-KBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達水平顯著升高;當ZIP8被敲除后,50μM ZnCl2加鋅處理同樣能夠使NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達水平顯著降低。Wstern blot結果顯示:50μM ZnCl2加鋅處理能夠顯著降低IKKβ、p-IKKβ以及細胞核內(nèi)p-NF-KBp65在蛋白水平上的表達;2.5μM TPEN缺鋅處理能夠顯著升高IKKβ、p-IKKβ以及細胞核內(nèi)p-NF-KBp65在蛋白水平上的表達;當ZIP8被敲除后,50μM ZnCl2加鋅處理同樣能夠顯著降低IKKβ、p-IKKβ以及細胞核內(nèi)p-NF-κBp65在蛋白水平上的表達。5.ZIP8和Zn2+對CaN活性的影響ZIP8過表達能夠顯著抑制由HCV core誘導的CaN活性的升高;ZIP8 RNA干擾能夠顯著誘導CaN活性的升高;50μM ZnCl2加鋅處理能夠顯著抑制由HCV core誘導的CaN活性的升高;2.5μM TPEN缺鋅處理能夠顯著誘導CaN活性的升高·,當ZIP8被敲除后,50μM ZnCl2加鋅處理同樣能夠顯著抑制由HCV core誘導的CaN活性的升高。由此可見,ZIP8可通過調控Zn2+來抑制由HCV core誘導的CaN活性的升高。6.細胞內(nèi)鋅含量的測定HCVc+ZIP8和HCVc+ZrnCl2對應于對照組HCVc熒光強度明顯增強;HCVc+ZIP8si和HCVc+TPEN對應于對照組HCVc熒光強度明顯減弱;HCVc+ZIP8si+ZnCl2對應于對照組HCVc+ZIP8si熒光強度明顯增強。結論:1.臨床標本結果顯示:與正常對照組相比,ZIP8mRNA表達水平在丙型肝炎患者中顯著降低;在治愈后丙肝患者中無明顯差異。推測ZIP8可能與HCV感染有一定的聯(lián)系。2.體外實驗顯示,ZIP8過表達和Zn2+可顯著抑制由HCV core誘導的炎癥因子表達的上調,NF-κB以及CaN活性的升高,而沉默表達ZIP8和缺鋅處理則呈現(xiàn)出相反的結果。由此可見,ZIP8可通過調控Zn2+抑制炎癥的發(fā)生,具體的機制有待進一步研究。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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本文編號：1663133