本文選題：周亡　切入點：內質網(wǎng)應激　出處：《北京中醫(yī)藥大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景:心血管疾病是全球致死率排行第一的慢性疾病,而糖尿病已經(jīng)被證明是心血管事件的一項高危因素。近年來糖尿病心肌病的發(fā)病率一直在不斷地增高,糖尿病心肌病發(fā)生的根本原因是糖尿病患者血糖的升高。心肌細胞的凋亡是糖尿病心肌病非常重要的病理表現(xiàn),并且通過減緩高血糖引起的心肌凋亡已經(jīng)被證實可以有效地預防糖尿病引起的心血管事件。近期與心肌細胞凋亡的調節(jié)機制相關的研究正不斷深入,細胞內質網(wǎng)應激介導的凋亡通路越發(fā)受到重視。對于內質網(wǎng)應激介導的凋亡機制的研究更可為中藥防治糖尿病心肌病的應用闡明新的原理。目的:探究糖尿病心肌病發(fā)病過程中H9C2細胞內質網(wǎng)應激的發(fā)生與變化情況,通過觀察大鼠心肌細胞H9C2內質網(wǎng)應激及其誘導的凋亡通路中相關指標的mRNA和蛋白的表達情況,探討中藥黃芪甲苷聯(lián)用葛根素對糖尿病心肌病的參預效果及機制。方法:(1)通過CCK-8法確定各濃度刺激物作用相應時間后對H9C2細胞是否具有毒性。(2)通過流式細胞儀檢測應用不同濃度甘露醇、葡萄糖及毒胡蘿卜素刺激后H9C2細胞的凋亡情況并通過Real-time PCR評價細胞中GRP78、IRE1 α及CHOP的表達情況。(3)不同濃度的黃芪甲苷及葛根素分別刺激H9C2細胞24、48、72小時后同正常組與高糖組對比,通過Real-time PCR方法評價GRP78、IRE1 α及CHOP的表達情況。(4)通過Real-time PCR方法檢測ERS抑制劑4-PBA三種不同濃度刺激24、48、72小時后H9C2細胞GRP78的表達情況。(5)將低糖培養(yǎng)的H9C2大鼠心肌細胞分為正常組、甘露醇對照組、高糖組、毒胡蘿卜素組、給藥組及抑制組,正常組用低糖培養(yǎng)基刺激,高糖組用高糖培養(yǎng)基刺激,給藥組用含葛根素及黃芪甲苷標準品的高糖培養(yǎng)基刺激,甘露醇對照組用加入30.5mmol/L甘露醇的低糖培養(yǎng)基刺激,抑制組用含有5mmol/L的內質網(wǎng)應激抑制劑4-PBA的高糖培養(yǎng)基刺激,上述各組均刺激24小時后,通過Real-time PCR及Western Blotting 方法檢測目標基因及蛋白 GRP78,IRE1 α,CHOP,PUMA,XBP1u,XBP1s 的表達情況。結果:(1)CCK-8結果實驗所用刺激物、藥物的不同濃度組及不同刺激時間組與正常組間的細胞吸光度均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)流式細胞儀檢測細胞凋亡結果24小時各濃度及時間的高糖與毒胡蘿卜素刺激均不能誘發(fā)H9C2細胞的凋亡,48小時的各濃度葡萄糖組及2 μmol/L、4 μmol/L濃度毒胡蘿卜素不能誘導出細胞凋亡,72小時140mmol/L的葡萄糖及4μmol/L、8μmol/L的毒胡蘿卜素可誘導細胞出現(xiàn)凋亡。不同濃度的葡萄糖及毒胡蘿卜素各3組分別刺激H9C2細胞24小時、48小時、72小時的PCR結果均顯示GRP78,IRE1α,CHOP指標的表達均比正常組增高,毒胡蘿卜素各組較高糖各組的表達也升高,差異均有統(tǒng)計學意義。(3)24小時和48小時的低、中、高劑量的黃芪甲苷組和葛根素組相應指標較高糖組均出現(xiàn)下降,且與高糖組有統(tǒng)計學差異,72小時葛根素低劑量組的IRE1 α較高糖組沒有統(tǒng)計學差異,各組CHOP的表達較高糖組均沒有統(tǒng)計學差異。(4)PCR結果顯示各濃度4-PBA刺激24小時內質網(wǎng)應激抑制組均可檢測到GRP78表達較正常組下降,且差異有統(tǒng)計學意義。(5)Real Time PCR檢測各目標基因mRNA表達量,除XBP1u是高糖組較正常組表達下降、毒胡蘿卜素組較正常組無統(tǒng)計學差異及給藥組較高糖組降低外,其他各基因均為高糖組及毒胡蘿卜素組較正常組及甘露醇對照組表達增高,給藥組及抑制組較高糖組表達下降,統(tǒng)計學均有統(tǒng)計學差異。(6)Western blotting 結果顯示,GRP78、IRE1 α、XBP1S、CHOP、PUMA 蛋白表達量均為高糖組及毒胡蘿卜素組較正常組及甘露醇對照組表達增高,給藥組及抑制組較高糖組表達下降,統(tǒng)計學均有統(tǒng)計學差異。結論:(1)長時間持續(xù)的高強的內質網(wǎng)應激可以誘發(fā)H9C2細胞的凋亡,本實驗中單純的高糖刺激(最長72小時)以及早期的毒胡蘿卜素刺激并不能直接誘發(fā)H9C2細胞的凋亡,但均可以誘發(fā)H9C2細胞啟動內質網(wǎng)應激。(2)黃芪甲苷及葛根素對高糖刺激H9C2細胞的內質網(wǎng)應激狀態(tài)及其誘發(fā)的凋亡通路起到抑制作用,但是后期對于凋亡通路的抑制作用欠佳。(3)黃芪甲苷聯(lián)用葛根素對于高糖誘導的H9C2細胞內質網(wǎng)應激及其誘發(fā)的凋亡通路相關基因和蛋白表達的抑制效果要優(yōu)于單用的效果。
[Abstract]:BACKGROUND : Cardiovascular disease is the first chronic disease in the world , and diabetes has been proved to be a high risk factor for cardiovascular events . The study of the mechanism of apoptosis in diabetic cardiomyopathy has been shown to be very important in recent years . Results : ( 1 ) There was no significant difference in the expression of GRP78 , IRE1.偽 , CHOP , PUMA , XBP1u and XBP1s in the control group . ( 4 ) The expression of GRP78 , IRE1.alpha , XBP1S , CHOP and PUMA was significantly higher than that in normal group and mannitol group .

【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：1654705