本文選題：RANKL　切入點：NFκB　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:明確核因子K B受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand,RANKL)對軟骨的直接作用及作用機制,為關節(jié)軟骨退變的治療提供新思路。方法:體外細胞實驗選用軟骨細胞株ATDC5,以明確RANKL對軟骨細胞的直接作用。體外培養(yǎng)采用牛軟骨片,以明確RANKL對軟骨組織的直接作用。體內(nèi)動物實驗采用C57BL/6J小鼠,以明確RANKL在體內(nèi)對關節(jié)軟骨的作用。第一部分:RT-PCR檢測正常軟骨細胞中核因子κ B受體活化因子(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B,RANK)和 RANKL 的表達,RT-qPCR 檢測軟骨細胞ATDC5在分化過程中Col2a1、Co110a、OPG、SOX9、RANK和RANKL的時空表達,Western蛋白印跡檢測RANKL刺激后ATDC5細胞中RANK的表達變化,HE、Alcian Blue和Safranin 0染色及Markin評分分析RANKL刺激對軟骨細胞或組織的直接作用。第二部分:RT-qPCR 檢測 RANKL 刺激后 ATDC5 細胞 Col2a1、MMP9、MMP13、ADAMTS5的時空表達變化,Western蛋白印跡檢測RANKL刺激后MMP13、ADAMTS5的時空表達變化,不同濃度的RANKL刺激對ADAMTS5表達的影響,及RANKL刺激0～120分鐘內(nèi)總IKB-α和磷酸化的IKB-α的表達變化。免疫熒光和激光共聚焦觀察p65的入核情況。IKB-α特異性抑制劑選用BAY11-7082。RANK沉默選用小干擾RNA。第三部分:Micro-CT檢測關節(jié)腔RANKL后脛骨骨體積分數(shù)的變化,RT-qPCR檢測股骨TRAP、Col2a1和Col10a的表達情況,HE染色分析關節(jié)軟骨的形態(tài)變化情況,免疫組織化學染色檢測Col2a1、Col10a、MMP9、MMP13、OPG、RANKL和ADAMTS5等蛋白的表達變化。采用SPSS17.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結果:1)軟骨細胞可以表達RANK及RANKL。在軟骨分化過程中,RANKL和RANK的表達隨時間增多。外源性RANKL刺激可以使軟骨細胞的RANK表達上調(diào)。外源性的RANKL刺激可導致軟骨結構紊亂,蛋白多糖丟失,Markin評分升高(P0.05)2)相對于對照組,RANKL刺激ATDC5細胞后,與軟骨退變相關的MMP9、MMP13和ADAMTS5的表達顯著升高,且有濃度依賴性;而軟骨標志因子II型膠原和X型膠原的mRNA水平顯著下降(P0.05)。RANKL刺激后細胞中總IKB-α的表達隨時間表達下降,磷酸化IKB-α開始隨時間表達增多,在30min表達達到峰值,隨后下降。免疫熒光染色后,激光共聚焦觀察到P65在30min時有明顯的入核。加入IKB-α特異性抑制劑BAY11-7082后,再次加入RANKL刺激ADAMTS5的表達增量隨著抑制劑濃度增加而下降。RANK沉默后,ADAMTS5的上調(diào)也不再觀察到。3)關節(jié)腔內(nèi)注射RANKL可以引起骨體積分數(shù)下降、Col2a1和Col10a的表達下降及TRAP的表達升高。HE染色顯示軟骨層空泡的出現(xiàn)及軟骨細胞數(shù)目的減少。免疫組織化學染色顯示,與軟骨標志蛋白Co12a、Col10a的表達下降,而與軟骨退化相關的ADAMTS5、MMP9、MMP13表達升高。與此同時,RANKL表達升高,而OPG的表達下降。結論:RANKL可以通過NFκ B信號通路來上調(diào)ADAMTS5的表達,直接導致軟骨退行性變。因此,可以以RANKL-NFκB-ADAMTS5信號軸為干預靶點,作為預防和治療關節(jié)軟骨退變的新途徑。
[Abstract]:Objective: to investigate the direct effect and mechanism of nuclear factor K B receptor activating factor ligand Receptor Activator for Nuclear Factor- 魏 B Ligand RANKL on cartilage. Methods: the chondrocyte line ATDC5 was selected in vitro to determine the direct effect of RANKL on chondrocytes. Bovine chondrocytes were cultured in vitro. In order to clarify the direct effect of RANKL on cartilage tissue, C57BL / 6J mice were used in animal experiment in vivo. In order to clarify the effect of RANKL on articular cartilage in vivo. The first part was to detect the expression of nuclear factor 魏 B receptor activating factor (Receptor Activator for Nuclear Factor- 魏 B RANK- 魏 B) and RANKL in normal chondrocytes by RT-qPCR. The changes of RANK expression in ATDC5 cells after RANKL stimulation were detected by Western blot and Markin scores were used to analyze the direct effect of RANKL stimulation on chondrocytes or tissues. Part 2: RT-qPCR was used to detect ATDC5 after RANKL stimulation. The temporal and spatial expression of ADAMTS5 in Col2a1 / MMP9 / MMP13 / MMP13 was detected by Western blot, and the expression of ADAMTS5 was detected by Western blot after RANKL stimulation, and the expression of ADAMTS5 was detected by Western blot. Effects of different concentrations of RANKL stimulation on ADAMTS5 expression, The expression of total IKB- 偽 and phosphorylated IKB- 偽 was observed by immunofluorescence and laser confocal focusing. The specific inhibitor of IkB- 偽 was BAY11-7082.RANK silencing and small interference RNA was selected by BAY11-7082.RANK silencing. Part 3: Micro-CT was used to detect RANKL in articular cavity. The changes of tibial bone volume fraction and the expression of TRAPL Col2a1 and Col10a in femur were detected by RT-qPCR. The morphological changes of articular cartilage were analyzed by HE staining. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of RANKL and ADAMTS5 proteins in Col2a1 / Col10aOMMP9 / MMP13OPGnL. The data were analyzed statistically by SPSS17.0 software package. Results: 1) chondrocytes could express RANK and RANKL. the expression of RANKL and RANK in chondrocytes during chondrogenic differentiation was observed over time. Exogenous RANKL stimulation can up-regulate RANK expression in chondrocytes. Exogenous RANKL stimulation can lead to cartilage structure disorder. Compared with the control group, the expression of MMP9, MMP9, MMP13 and ADAMTS5, which were associated with cartilage degeneration, was significantly increased in a dose-dependent manner. However, the mRNA level of type II collagen and type X collagen decreased significantly after stimulation with P0.05. RANKL. The expression of total IKB- 偽 decreased with time, and the expression of phosphorylated IKB- 偽 began to increase with time, and reached its peak at 30 minutes. After immunofluorescence staining, laser confocal observation showed that p65 had obvious nucleation at 30min. After adding IKB- 偽 specific inhibitor BAY11-7082, The expression increment of ADAMTS5 stimulated by RANKL again decreased with the increase of inhibitor concentration. After rank silencing, the upregulation of ADAMTS5 was also no longer observed. 3) Intraarticular injection of RANKL could induce the decrease of bone volume fraction and the expression of Col2a1 and Col10a and the surface of TRAP. He staining showed the appearance of chondrocyte vacuoles and the decrease of chondrocytes. Immunohistochemical staining showed that, The expression of ADAMTS5, MMP9, MMP13, which is associated with cartilage degeneration, decreased, while the expression of RANKL increased, while the expression of OPG decreased. Conclusion the expression of ADAMTS5 can be upregulated by the NF 魏 B signaling pathway. Therefore, RANKL-NF 魏 B-ADAMTS5 signal axis can be used as a new approach to prevent and treat articular cartilage degeneration.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R782.6

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本文編號：1564115