本文關(guān)鍵詞： B細(xì)胞淋巴瘤 B細(xì)胞受體 免疫球蛋白D 免疫球蛋白D受體 融合蛋白hIgD-Fc-Ig　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：淋巴瘤(lymphoma)起源于淋巴結(jié)和淋巴組織,是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。淋巴瘤按照細(xì)胞起源分為:B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞和NK細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。淋巴瘤具有高度異質(zhì)性,故治療上也差別很大,目前淋巴瘤的臨床治療仍是以聯(lián)合化療為主,但因其毒副作用及耐藥性限制了臨床使用。因此,開發(fā)新的有效治療藥物,提高淋巴瘤的治療效果已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。隨著CD20單克隆抗體美羅華的問世,開創(chuàng)了腫瘤靶向治療的先河,越來越多的B細(xì)胞淋巴瘤治療新靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。其中BCR(B cell receptor)和BTK(Brutons tyrosine kinase)激酶抑制劑伊魯替尼Ibrutinb在B細(xì)胞淋巴瘤的治療中已經(jīng)取得了突破性成果。BCR復(fù)合物及其介導(dǎo)的下游信號(hào)途徑在正常B細(xì)胞及多種腫瘤B細(xì)胞中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,調(diào)控其途徑關(guān)鍵分子的活性可以選擇性地促進(jìn)或抑制特定B細(xì)胞擴(kuò)增。BCR分為Ig M(Immunoglobulin M)類型BCR和Ig D(Immunoglobulin D)類型BCR,其中m Ig D(Membrane Ig D)介導(dǎo)的信號(hào)通路包括在BCR信號(hào)通路之中。免疫球蛋白D(Ig D)包括s Ig D(Secreted Ig D)和m Ig D,在抗原識(shí)別、B淋巴細(xì)胞活化以及免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)上發(fā)揮重要作用。臨床發(fā)現(xiàn),Ig D型骨髓瘤患者s Ig D明顯升高,感染性疾病和自身免疫病患者血液中s Ig D水平也較高,包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)s Ig D在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)患者血清中表達(dá)較健康志愿者明顯升高;h Ig D蛋白可以上調(diào)Burkitt淋巴瘤細(xì)胞Daudi表面IgDR的表達(dá),可以顯著地促進(jìn)Daudi細(xì)胞的增殖,減少細(xì)胞凋亡,加速細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。結(jié)果提示Ig D-IgDR通路有可能成為治療B細(xì)胞惡性增殖相關(guān)疾病的新靶點(diǎn),阻斷Ig D-IgDR之間的相互作用可能成為B細(xì)胞淋巴瘤免疫新療法。課題組以IgDR為靶點(diǎn)成功將h IgD-Fc與h IgG-Fc融合并構(gòu)建了融合蛋白h Ig D-Fc-Ig(已申請(qǐng)專利),旨在特異性阻斷Ig D-IgDR通路。本課題以B淋巴瘤細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察IgDR在Daudi和Ramos細(xì)胞上的表達(dá)情況并比較h Ig D、h Ig D-Fc、h Ig D-Fc-Ig在Daudi和Ramos細(xì)胞上與IgDR結(jié)合的親和力大小,檢測h Ig D對(duì)Daudi和Ramos細(xì)胞的增殖、凋亡、周期的作用及h Ig D-Fc-Ig融合蛋白對(duì)h Ig D上述作用的影響,并進(jìn)行了部分機(jī)制的研究,探討Ig D及IgDR在B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病中發(fā)揮的作用,為h Ig D-Fc-Ig成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的創(chuàng)新藥物提供可能的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:觀察IgDR在Daudi和Ramos細(xì)胞上表達(dá)情況,比較h Ig D、h Ig D-Fc和h Ig D-Fc-Ig在Daudi和Ramos細(xì)胞上與IgDR結(jié)合的親和力大小,檢測h Ig D對(duì)Daudi和Ramos細(xì)胞的增殖、凋亡、周期的作用及h Ig D-Fc-Ig融合蛋白對(duì)h Ig D上述作用的影響,并研究部分機(jī)制,探討Ig D及IgDR在B淋巴瘤細(xì)胞中所起的作用以及為h Ig D-Fc-Ig成為治療B細(xì)胞淋巴瘤的創(chuàng)新藥物提供可能的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:體外培養(yǎng)Daudi和Ramos細(xì)胞,使用不同濃度的h Ig D和h Ig D-Fc-Ig處理細(xì)胞后,采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性;臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測Daudi及Ramos細(xì)胞上IgDR的表達(dá)情況,h Ig D、h Ig D-Fc和h Ig D-Fc-Ig與IgDR結(jié)合的親和力大小以及細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡率;Western blot法檢測不同處理方式下Daudi和Ramos細(xì)胞c-myc、cyclin D3、CDK6、p16~(INK4a)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.IgDR在淋巴瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況及h Ig D、h Ig D-Fc和h Ig D-Fc-Ig與IgDR的親和力檢測。使用本課題組建立的流式細(xì)胞術(shù)檢測IgDR表達(dá)的方法,發(fā)現(xiàn)Daudi和Ramos細(xì)胞上均有IgDR的表達(dá)。使用本課題組建立的非放射性熒光標(biāo)記的配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法,檢測h Ig D、h Ig D-Fc及h Ig D-Fc-Ig與Daudi細(xì)胞上IgDR結(jié)合的Scatchard直線方程分別是Y=-0.567X+2072.8(r2=0.8796),Y=-3140.2X+107(r2=0.6792),Y=-901.53X+2×106(r2=0.9097);得出解離常數(shù)K_D和受體最大結(jié)合容量B_(max)分別是9.6×10-9M和3656 arbitrary unit/104 cells、1.27×10-11M和3184arbitrary unit/104 cells、2.21×10-11M和2219 arbitrary unit/104 cells。流式細(xì)胞術(shù)檢測Ig D、Ig D-Fc及Ig D-Fc-Ig與Ramos細(xì)胞上IgDR結(jié)合的Scatchard直線方程分別是Y=-0.1583X+194.43(r 2=0.6165),Y=-1146.6X+1011(r 2=0.7047),Y=-6.7507X+6×108(r 2=0.8074);得出解離常數(shù)K_D和受體最大結(jié)合容量B_(max)分別是3.4×10-8M和1228 arbitrary unit/104 cells、3.48×10-11M和8.7×107arbitrary unit/104 cells、2.96×10-9M和8.9×107 arbitrary unit/104 cells。2.h Ig D對(duì)淋巴瘤細(xì)胞Daudi和Ramos的增殖、凋亡和周期的作用及h Ig D-Fc-Ig融合蛋白對(duì)h Ig D上述作用的影響。體外培養(yǎng)并選取對(duì)數(shù)生長期的Daudi及Ramos細(xì)胞,用不同濃度的h Ig D(1,3,10μg/ml)刺激不同時(shí)間(12,24,36,48,72 h),觀察細(xì)胞活力和增殖情況。結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,h Ig D明顯促進(jìn)Daudi、Ramos細(xì)胞的活力和增殖。用h Ig D(3μg/ml)和不同濃度的h Ig D-Fc-Ig(0,0.3,1,3,10,30,100μg/ml)同時(shí)作用于細(xì)胞,培養(yǎng)不同時(shí)間(12,24,36,48,72 h),結(jié)果表明:h Ig D-Fc-Ig抑制了h Ig D的促增殖作用;Annexin-V/PI流式檢測結(jié)果顯示h Ig D(3μg/ml)降低了Daudi和Ramos細(xì)胞的凋亡率,h Ig D-Fc-Ig(10,30μg/ml)增加了其凋亡率;PI流式檢測結(jié)果顯示h Ig D(3μg/ml)下調(diào)了Daudi和Ramos細(xì)胞G1期的比例,增加了S期的比例,G2期變化不明顯,h Ig D-Fc-Ig(10,30μg/ml)使Daudi和Ramos細(xì)胞周期阻滯在G1期。進(jìn)一步檢測Daudi和Ramos細(xì)胞c-myc、cyclin D3、CDK6和p16~(INK4a)因子的蛋白表達(dá),Western結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,h Ig D(3μg/ml)刺激后Daudi和Ramos細(xì)胞c-myc、cyclin D3、CDK6的蛋白表達(dá)明顯升高,p16~(INK4a)表達(dá)明顯降低,而h Ig D-Fc-Ig(10,30μg/ml)作用后下調(diào)了c-myc、cyclin D3、CDK6的蛋白表達(dá),上調(diào)了p16~(INK4a)的表達(dá)。結(jié)論:1.Daudi和Ramos細(xì)胞表面均有IgDR的表達(dá)。2.h Ig D、h Ig D-Fc及h Ig D-Fc-Ig均可與Daudi和Ramos細(xì)胞上IgDR結(jié)合,且與Daudi細(xì)胞上IgDR結(jié)合的親和力高于Ramos細(xì)胞。3.在Daudi和Ramos細(xì)胞上h Ig D、h Ig D-Fc及h Ig D-Fc-Ig與IgDR結(jié)合的親和力大小均為h Ig D-Fch Ig D-Fc-Igh Ig D。4.h Ig D加快Daudi和Ramos細(xì)胞周期進(jìn)程,減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,可能與其調(diào)控c-myc與cyclin D3-CDK6-p16~(INK4a)表達(dá)有關(guān)。5.h Ig D-Fc-Ig阻斷了h Ig D的上述作用:抑制Daudi和Ramos細(xì)胞的增殖,增加細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞周期阻滯在G1期,可能是通過阻滯Ig D-IgDR通路發(fā)揮作用。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號(hào)：1543013