發(fā)布時(shí)間：2018-02-10 02:45

  本文關(guān)鍵詞： 超氧化物歧化酶 殼聚糖衍生物(O-HTCC) 結(jié)合物 長期穩(wěn)定性 炎癥性腸病 活性氧自由基 巨噬細(xì)胞　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)主要指 HO·、O2·-和 H2O2 等,是正常氧代謝的副產(chǎn)物,在細(xì)胞的增殖與分化中有舉重若輕的地位。然而,過量的ROS可引發(fā)氧化應(yīng)激(oxidative stress)反應(yīng),最終可能導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的疾病。其中,炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)作為臨床常見的腸道疾病,具有復(fù)發(fā)性。盡管該病的病因仍然不能完全確定,但其嚴(yán)重程度與體內(nèi)ROS的水平密切相關(guān)。因此,清除體內(nèi)積累的過多的ROS被認(rèn)有是緩解IBD的可行策略。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是機(jī)體抗氧化體系的關(guān)鍵酶,將胞內(nèi)超氧陰離子歧化為氧和水是其參與的重要反應(yīng)。因此,外源SOD酶被認(rèn)為是治療ROS相關(guān)疾病的潛在治療劑。針對SOD穩(wěn)定性差、半衰期短及難以進(jìn)入細(xì)胞的缺點(diǎn),本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上,采用水溶性好的6-0-季銨化殼聚糖衍生物——6-0-2'-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(6-0-2-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan,O-HTCC)對 SOD 的末端羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,純化得到O-HTCC-SOD結(jié)合物。通過測定酶活的變化比較了結(jié)合物與天然SOD在室溫下長期儲存時(shí)的穩(wěn)定性差異。利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)建立小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型,ELISA試劑盒測定結(jié)合物對細(xì)胞炎癥因子分泌的影響,熒光探針DCFH-DA測定結(jié)合物對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。最后,利用葡聚糖硫酸鈉(dextransulfatesodium,DSS)建立小鼠急性結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?深入探討了結(jié)合物對急性結(jié)腸炎的治療效果。本學(xué)位論文取得的主成果如下:1.O-HTCC-SOD的制備及性質(zhì)分析通過三步化學(xué)反應(yīng)將含季銨基團(tuán)的2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTMAC)連接到殼聚糖C6位的羥基上,純化得到水溶性良好的6-0-季銨化殼聚糖衍生物(命名為O-HTCC),產(chǎn)率達(dá)到81.2%,IR和1HNMR確定了結(jié)構(gòu)的正確性。使用茚三酮比色法測定自由氨基含量,得到的O-HTCC的自由氨基率高達(dá)71.5%。SOD的末端羧基經(jīng)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)活化后,與O-HTCC的自由氨基形成酰胺鍵得到修飾產(chǎn)物O-HTCC-SOD,修飾率超過70%。經(jīng)弱陰離交換柱層析純化得到結(jié)合物精品。純化組分通過SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳驗(yàn)證,分析表明修飾產(chǎn)物的分子量明顯增大,且為連續(xù)分布的多組分。連續(xù)測定初始酶活相同的天然SOD與O-HTCC-SOD在室溫下的酶活保留率,結(jié)果表明,室溫下存放30 d后結(jié)合物的酶活保留率高達(dá)86.8%,而SOD僅為44.1%。因此,O-HTCC-SOD在室溫條件下的長期穩(wěn)定性顯著高于未修飾的SOD,有利于SOD酶的長期儲存。2.O-HTCC-SOD的體外抗炎作用評價(jià)淀粉肉湯法收集得到小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,MTT比色法測定O-HTCC-SOD對細(xì)胞的毒性,結(jié)果表明:在劑量范圍為10U/mL～1250 U/mL時(shí),O-HTCC-SOD與SOD均未表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。利用LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,建立體外炎癥模型。通過ELISA試劑盒測定,發(fā)現(xiàn)O-HTCC-SOD與SOD均能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子,如TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生,但未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性,提示其作用源于SOD酶的催化活性。巨噬細(xì)胞經(jīng)O-HTCC-SOD或天然SOD預(yù)處理后,與LPS共同孵育6 h,,然后裝載熒光探針DCFH-DA,測定細(xì)胞內(nèi)的ROS水平,結(jié)果表明:O-HTCC-SOD預(yù)處理的細(xì)胞的ROS水平顯著低于模型組(P0.01);SOD組的ROS水平則未有顯著下降(P0.05)。這一結(jié)果表明,O-HTCC修飾的SOD入胞能力增強(qiáng),從而提高了 SOD的清除胞內(nèi)ROS的能力。3.O-HTCC-SOD對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的防護(hù)作用評價(jià)通過使BALB/c小鼠口服5%葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立急性結(jié)腸炎模型,尾靜脈注射不同劑量的O-HTCC-SOD,深入研究其抗炎作用,并比較O-HTCC-SOD、未修飾的SOD、O-HTCC與SOD的混合物的治療效果的差異。結(jié)果顯示:連續(xù)5天自由飲用5%的DSS可使小鼠表現(xiàn)出典型的急性結(jié)腸炎癥狀,包括體重明顯下降,疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)顯著升高,結(jié)腸長度大大縮短,結(jié)腸組織的髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)水平顯著升高。并且,結(jié)腸病理切片觀察發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)腸部位損傷,例如上皮和杯狀細(xì)胞損失、隱窩病變和大面積的炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比,O-HTCC-SOD顯著抑制了 DSS導(dǎo)致的體重下降、DAI升高、結(jié)腸長度縮短及MPO活性升高(P0.01),并大大減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸病理學(xué)損傷。相比之下,天然SOD及其與O-HTCC的混合物除能在一定程度上抑制DAI和MPO活性升高(P0.05)外,對結(jié)腸長度縮短、病理學(xué)改變等癥狀未能表現(xiàn)出明顯改善(P0.05)。因此,與天然SOD相比,經(jīng)O-HTCC修飾得到的O-HTCC-SOD治療DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的效果顯著增強(qiáng)。此外,O-HTCC-SOD對結(jié)腸炎的體內(nèi)量效關(guān)系研究表明:不同劑量(1.5 kU/kg～6.0 kU/kg)結(jié)合物均能顯著抑制DSS導(dǎo)致的DAI升高(P0.05),但未呈明顯的劑量依賴性;劑量為3.0kU/kg時(shí)對結(jié)腸縮短抑制作用最佳;劑量為3.0～4.5 kU/kg時(shí),對MPO水平抑制作用最佳。總之,O-HTCC-SOD在劑量為3.0 kU/kg時(shí),對DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎具有最佳的治療效果。4.O-HTCC-SOD的免疫原性本文選用以SOD和O-HTCC-SOD為免疫原對BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。第一次免疫兩周后,進(jìn)行第二次免疫,再隔兩周,摘眼球取血得到血清,用間接ELISA法檢測各組小鼠血清中的IgG水平。O-HTCC-SOD的免疫效價(jià)明顯較未修飾的SOD低。綜上所述,SOD經(jīng)殼聚糖的衍生物O-HTCC修飾,得到的結(jié)合物O-HTCC-SOD在室溫下長期保存時(shí),穩(wěn)定性顯著提高;O-HTCC-SOD能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎癥因子和胞內(nèi)ROS釋放;O-HTCC-SOD對DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎有明顯的緩解作用,是一種具有研究和開發(fā)價(jià)值的新型抗結(jié)腸炎候選藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R943;R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1499474