本文關(guān)鍵詞： 病毒宏基因組學(xué) Illumina Miseq測序 兒童腹瀉 腸道內(nèi)容物 病毒群落 新型病毒 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 重組分析 流行病學(xué)　出處：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腹瀉是目前全世界比較常見的一類腸道疾病,給人類健康帶來巨大的威脅。腹瀉容易侵犯兒童和老年群體,急性腹瀉是世界范圍內(nèi)尤其是欠發(fā)達(dá)國家嬰幼兒常見的疾病,是導(dǎo)致嬰幼兒死亡的主要原因之一。病原微生物感染(包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲)是引起腹瀉的重要病因,其中病毒感染則是最主要的病因,在兒童群體常引起散發(fā)或暴發(fā)性腹瀉。隨著經(jīng)濟(jì)實(shí)力不斷發(fā)展、醫(yī)療衛(wèi)生條件的不斷改善和飲水和衛(wèi)生條件的大力改善,人類已經(jīng)開發(fā)大量有效用于治療細(xì)菌性腹瀉的抗生素,而病毒感染導(dǎo)致的腹瀉尚未得到有效控制和關(guān)注,從而致使細(xì)菌性腹瀉的發(fā)病率逐漸少于病毒性腹瀉,病毒性腹瀉的致病病原體仍然沒有得到清晰闡明。因此,了解和掌握腹瀉病毒的組成及流行情況,對于防控及治療病毒性腹瀉具有重要的意義。目前傳統(tǒng)的病毒鑒定及檢測方法主要針對已知或變異度較小的病毒,在未知或新型病毒導(dǎo)致的新發(fā)傳染病病原體確認(rèn)上具有較大的局限性;近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及挖掘新病毒的需求,一大批非培養(yǎng)依賴的病毒挖掘及鑒定技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,而其中病毒宏基因組學(xué)(Viral Metagenomics)逐漸顯示出其巨大的優(yōu)越性,已經(jīng)成為未知新型病毒確認(rèn)的的重要手段。本研究的主要目的是采用病毒宏基因組學(xué)方法分析腹瀉兒童群體中病毒群落的組成,同時(shí)對新型致腹瀉病毒病毒進(jìn)化和遺傳關(guān)系進(jìn)行研究,為新型病毒引起的急性腹瀉的預(yù)防、診斷和治療奠定基礎(chǔ),對未來新型病毒引起相關(guān)疾病病原體的快速確認(rèn)具有重要的實(shí)際意義。本研究主要內(nèi)容和結(jié)果如下:(一)兒童腹瀉腸道病毒群落的組成利用非培養(yǎng)依賴的病毒組學(xué)研究方法,采集腹瀉兒童糞便樣品,構(gòu)建適用于Illumina Miseq平臺的病毒組基因組文庫,利用Miseq平臺進(jìn)行高通量測序,獲得原始文庫核酸數(shù)據(jù)之后,進(jìn)行一系列基于病毒核酸信息的生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示,兒童腹瀉糞便樣品中病毒群落組成如下:腺病毒科(Adenoviridae),指環(huán)病毒科(Anelloviridae),杯狀病毒科(Caliciviridae),細(xì)小病毒科(Parvoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),呼腸孤病毒科(Reoviridae),星狀病毒科(Astroviridae),雙小RNA病毒科(Picornaviridae),短尾噬菌體科(podoviridae),環(huán)狀病毒科(circoviridae),二順反子病毒科(dicistroviridae),藻類去氧核糖核酸病毒科(phycodnaviridae),痘病毒科(poxviridae),逆轉(zhuǎn)錄病毒科(retroviridae),番茄叢矮病毒科(tombusviridae),桿狀病毒科(baculovoridae),皰疹病毒科(herpesviriade),微小噬菌體科(microviridae),虹彩病毒科(iridoviridae),乳頭瘤病毒科(papillomaviridae),人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科(herv),黃病毒科(flaviviridae),冠狀病毒科(coronaviridae),蒂狀病毒科(virgaviridae)以及未分科病毒和其他病毒。病毒群落分析提示:(1)兒童腸道病毒群落組成能與腹瀉相關(guān)的病毒包括有杯狀病毒科、星狀病毒科、細(xì)小病毒科、雙小rna病毒科、小rna病毒科、副腸孤病毒科,病毒文庫滴度分析結(jié)果顯示,這些病毒類群構(gòu)成兒童腹瀉病毒群落的構(gòu)成了病毒群落的主體;(2)病毒滴度分析結(jié)果顯示diafeces05-diafeces09病毒文庫中所含病毒滴度較高,病毒種類較多。而diafeces01-04和diafeces10病毒滴度較小;(3)在以前的引起腹瀉的主要病原體為杯狀病毒科,雖然在本次江蘇局部地區(qū)的兒童腹瀉腸道病毒群落組成杯裝病毒科仍占有一半以上的比例,但是此次研究杯狀病毒科不是導(dǎo)致腹瀉病因。(二)兒童腹瀉腸道內(nèi)一種新型人類雙�？刹《�(humanparechovirus)的鑒定(1)新型hpev的基因組結(jié)構(gòu)及遺傳特征分析基于腹瀉兒童病毒群落內(nèi)各病毒基因組序列的生物信息學(xué)分析顯示,在兒童腹瀉的糞便樣品中發(fā)現(xiàn)一株新型人類雙�？刹《緃pev(命名為ch-zxy1),在遺傳關(guān)系上與已知病毒具有較大的分歧度,可能為新型hpev毒株。因此,利用相關(guān)信息學(xué)軟件如geneious中的assembly功能和基于病毒基因組的genomemapping方法,獲得了該病毒的全基因組序列,該全基因組序列進(jìn)一步經(jīng)過普通pcr法確認(rèn)。結(jié)果顯示,ch-zxy1全基因組序列為7,213nt,基于ch-zxy1全基因組序列系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示ch-zxy1和hpev5ch-zi1聚集形成了單獨(dú)的一個進(jìn)化枝;基于ch-zxy1毒株全基因組序列在genebank中blastn結(jié)果顯示ch-zxy1與hpev5ch-zj1序列相似度為84%。本研究基于hpev病毒的3個主要基因(p1、p2及p3)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,基于3個不同基因區(qū)域系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示ch-zxy1毒株分別和hpev5ch-zj1,hpev4fuk2005-123,hpev1kvp6緊密激烈;進(jìn)而基于p1、p2和p3區(qū)域的核苷酸序列在genebank中做blastn搜索,結(jié)果顯示ch-zxy1分別與p1,p2,p3核苷酸序列在genebank中blastn的結(jié)果顯示顯hpev5ch-zj1,hpev4fuk2005-123,hpev1kvp6人類雙�？刹《镜男蛄邢嗨贫茸罡�,分別為82.8%,83%,91%�；赾h-zxy1基因組的系統(tǒng)進(jìn)化及序列分析結(jié)果顯示,該毒株的不同基因區(qū)域與其他的毒株的遺傳關(guān)系不盡相同,暗示該毒株可能存在基因組同源重組可能。(2)hpev病毒重組分析基于本研究發(fā)現(xiàn)的hpev毒株ch-zxy1及genbank檢索的相關(guān)毒株全基因組序列,進(jìn)行病毒基因同源重組分析,分析結(jié)果顯示ch-zxy1可能為重組毒株,該重組事件發(fā)生在hpev1代表毒株br/53/2006(hq696575)和hpev5代表毒株bni-788st(ef051629)之間�；诨蛲粗亟M斷裂點(diǎn)兩端的基因序列分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,結(jié)果顯示基于不同區(qū)段構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中ch-zxy1分別和hpev1bni-788st及hpev5br/53/2006聚類,從而證實(shí)了重組事件�；谥亟M斷裂點(diǎn)設(shè)計(jì)的pcr擴(kuò)增也進(jìn)一步驗(yàn)證該重組屬于自然發(fā)生的重組事件。(3)hpev在鎮(zhèn)江地區(qū)腹瀉兒童群體的流行情況研究為了闡明該hpev毒株是否與鎮(zhèn)江地區(qū)兒童腹瀉疾病的相關(guān)性及該地區(qū)腹瀉兒童群體hpev的流行情況。本研究從鎮(zhèn)江地區(qū)采集110名腹瀉患兒及50名體檢對照兒童的糞便標(biāo)本,以hpev通用兼并引物檢測hpev在腹瀉兒童群體的攜帶情況,結(jié)果顯示腹瀉兒童糞便樣品hpev陽性15例,總檢出率為13.6%,陽性hpev樣品的擴(kuò)增條帶經(jīng)過克隆測序,結(jié)果顯示其中hpev1為7份占46.6%。50份正常對照糞便標(biāo)本中,5份hpev陽性標(biāo)本,檢出率10%(5/50);5陽性hpev樣品的擴(kuò)增條帶經(jīng)過克隆測序,結(jié)果顯示3例hpev1,2例hpev6,與腹瀉檢出率相比,沒有明顯的差別。在腹瀉兒童糞便樣品中還檢測到了較少流行的hpev6和hpev7,基于以上研究結(jié)果,江蘇地區(qū)兒童腹瀉群體內(nèi)hpev1為主要的流行型別。結(jié)論:(1)本研究運(yùn)用病毒宏基因組方法成功的地解析了江蘇部分地區(qū)腹瀉腸道內(nèi)病毒群落的組成(2)本研究從腹瀉兒童糞便樣品中分離出一株新型hpev毒株并獲得其全基因組序列(3)系統(tǒng)進(jìn)化及重組分析顯示該毒株為不同基因型hpev之間重組事件產(chǎn)生的重組體(4)初步闡明hpev在鎮(zhèn)江地區(qū)腹瀉兒童群體的流行狀況。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R725.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 季夢辰;崔立紅;;急性病毒感染性腹瀉病原體研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2016年07期

2 羅婭莎;林勇平;宋金龍;梁穎;周強(qiáng);盧妙蓮;;病毒宏基因組高通量測序在臨床感染性疾病診斷中的應(yīng)用[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2014年12期

3 羅雷;朱汝南;;人副腸孤病毒的研究進(jìn)展[J];中國病毒病雜志;2013年04期

4 林羨華;冉陸;馬莉;王子軍;馮子健;;2010年全國其他感染性腹瀉報(bào)告病例信息分析[J];中國食品衛(wèi)生雜志;2011年05期

5 張輝;崔煥忠;;宏基因組學(xué)及其研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年03期

6 張昕;高永軍;馮子健;王子軍;冉陸;;2008年全國其他感染性腹瀉報(bào)告病例信息分析[J];世界華人消化雜志;2009年32期

7 李艷艷;;土壤微生物的宏基因組學(xué)及其研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2008年15期

8 趙月峨;王淑蘭;史套興;;新發(fā)傳染病出現(xiàn)的機(jī)制和影響因素分析[J];解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

9 徐建國;新發(fā)傳染病的現(xiàn)狀與對策[J];中華流行病學(xué)雜志;2003年05期

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