本文關(guān)鍵詞：西瑞香素對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖抑制作用和在細(xì)胞中的代謝研究　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種罕見(jiàn)的惡性腫瘤,高發(fā)于5歲以下的兒童。目前能夠治療該疾病的藥物很少,所以尋找有效藥物很有必要。西瑞香素(Daphnoretin),化學(xué)名7-為羥基-6-甲氧基-3,7'-雙香豆素酯,又稱雙白瑞香素,具有以醚鍵結(jié)合的雙香豆素類衍生物的結(jié)構(gòu),在菊科、瑞香科等植物中均有發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)西瑞香素具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗焦慮等藥理作用,所以本實(shí)驗(yàn)采用該藥物進(jìn)行研究,探索其能否對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有效。目的:通過(guò)進(jìn)行神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y的增殖抑制、凋亡、周期實(shí)驗(yàn),研究該化合物是否對(duì)神經(jīng)母瘤細(xì)胞起作用。建立神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中西瑞香素的HPLC檢測(cè)方法,通過(guò)西瑞香素在神經(jīng)母瘤細(xì)胞中的攝取和消除實(shí)驗(yàn)為西瑞香素的細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)研究提供初步的理論依據(jù)。探索西瑞香素能否成為治療人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的藥物,為治療該疾病提供幫助。方法:采用經(jīng)典的MTT(四氮唑鹽)法,計(jì)算西瑞香素對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞不同給藥濃度下的存活率,來(lái)評(píng)價(jià)西瑞香素對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。標(biāo)記了FITC的AnnexinV可以作為熒光探針結(jié)合早期凋亡神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞上的磷脂酰絲氨酸,PI(碘化丙啶)核酸染料可以與凋亡中晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞核結(jié)合,兩種染料同時(shí)使用可將早期凋亡和晚期、壞死的細(xì)胞區(qū)分開(kāi),實(shí)驗(yàn)采用熒光顯微鏡觀察不同濃度西瑞香素對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡情況的影響。采用PI染色法對(duì)給藥細(xì)胞進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)西瑞香素對(duì)神經(jīng)母瘤細(xì)胞周期的影響。用JC-1染色法檢測(cè)西瑞香素對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)西瑞香素對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移能力的影響。建立細(xì)胞內(nèi)西瑞香素的HPLC含量測(cè)定方法,并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證。然后用建立的方法測(cè)定在一定時(shí)間內(nèi),細(xì)胞對(duì)西瑞香素的攝取和消除情況,研究血清和維拉帕米對(duì)西瑞香素在SH-SY5Y細(xì)胞中含量是否有影響。結(jié)果:MTT試驗(yàn)結(jié)果表明,西瑞香素對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y有增殖抑制作用。神經(jīng)母瘤細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明西瑞香素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,濃度為10μg/mL時(shí),主要誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡,隨著給藥濃度的增加晚期和壞死細(xì)胞數(shù)量增加。細(xì)胞周期試驗(yàn)顯示,給藥后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在S期的比例升高,說(shuō)明西瑞香素能夠阻滯細(xì)胞周期,主要是阻滯細(xì)胞由S期向G2期的進(jìn)行。JC-1染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明西瑞香素能夠降低線粒體膜電位,進(jìn)一步驗(yàn)證西瑞香素能夠誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明西瑞香素對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移能力也有影響。細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果:用Phenomenex C18(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-磷酸水溶液(55:45,v/v,pH≈3.0),流速1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm,柱溫30 0C分離效果良好。本方法在0.02-20.0μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好,最低定量限為0.05μg·mL-1,標(biāo)準(zhǔn)線性方程為Y=80620X+5962,R2大于0.99。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度1.0,5.0,10.0μg·mL-1的西瑞香素第一天的日內(nèi)精密度的RSD分別是:9.34%,2.97%,2.24%;第二天的日內(nèi)精密度是9.55%,2.27%,4.60%;第三天的日內(nèi)精密度為6.35%,1.54%,2.74%;日間精密度是8.91%,2.41%,3.61%。準(zhǔn)確度的RSD值是5.69%,6.11%,3.35%;室溫立即處理、在室溫放置24h、4℃放置24h穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別是14.85%,6.03%,8.29%;11.97%,3.16%,5.54%;11.11%,4.67%,5.02%。提取回收率不同濃度的提取回收率的RSD值分別為:2.18%,1.65%,3.49%。所有RSD%均小于15%,說(shuō)明建立的HPLC方法學(xué)可用。超聲裂解結(jié)果表明裂解30 min檢測(cè)藥物含量最高。西瑞香素的攝取量與時(shí)間相關(guān)隨著時(shí)間的增加攝取量增加,在6-8h達(dá)到穩(wěn)態(tài),并且在含血清狀態(tài)下西瑞像素的攝取量比在無(wú)血清狀態(tài)下的攝取量高。消除實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,西瑞香素在細(xì)胞中的消除隨著時(shí)間逐漸減少。加入10μM、50μM的維拉帕米與不含維拉帕米組的細(xì)胞中西瑞香素的量沒(méi)有顯著性差異,說(shuō)明西瑞香素轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不存在P-糖蛋白的外排作用。討論:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有一定的增殖抑制作用,能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,對(duì)細(xì)胞周期和遷移能力也有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)建立的西瑞香素細(xì)胞樣品檢測(cè)的HPLC方法效率高、專屬性高、靈敏度較好,可對(duì)細(xì)胞藥動(dòng)學(xué)研究提供方法學(xué)的依據(jù)。西瑞香素在細(xì)胞中的攝取和消除作用研究,可為探索西瑞香素在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective : To study the effect of ciresinol on the cell cycle of neuroblastomas by means of MTT ( MTT ) method .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

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