本文關(guān)鍵詞：人降鈣素原的原核表達(dá)及不同介質(zhì)下穩(wěn)定性研究　出處：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:體外原核表達(dá)人降鈣素原(Procalcitonin,PCT)基因,獲取高純度PCT重組蛋白;優(yōu)化PCT重組蛋白表達(dá)條件;制備鼠源性多克隆抗體;分析臨床PCT檢測(cè)的主要影響因素并探討PCT重組蛋白最佳儲(chǔ)存介質(zhì)。方法:根據(jù)NCBI上人降鈣素原的基因序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,PCR技術(shù)擴(kuò)增全長(zhǎng)序列,經(jīng)DNA膠回收、質(zhì)粒提取、基因連接和酶切鑒定等步驟,構(gòu)建原核表達(dá)重組載體PCT/p ET-22b(+)。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21并誘導(dǎo)表達(dá),觀察誘導(dǎo)劑濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)、誘導(dǎo)時(shí)間(4h、8h、12h、16h、20h)、誘導(dǎo)溫度(22℃、27℃、32℃、37℃)及轉(zhuǎn)速(80、120、160、200、250 r/min)等對(duì)蛋白表達(dá)的影響。采用鎳柱親和層析法純化PCT重組蛋白,并用Western blotting和膠體金法對(duì)其鑒定。純化的PCT重組蛋白與等體積佐劑充分研磨乳化后,免疫Balb/c小鼠,第三次免疫7天后采集血液并分離血清,用ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。分析血液標(biāo)本類(lèi)型、保存時(shí)間和溫度對(duì)PCT檢測(cè)的影響;以生理鹽水、小牛血清和PBS稀釋PCT重組蛋白,分別檢測(cè)保存5d、10d、20d、30d的PCT濃度變化,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約350 bp。同源性比對(duì)分析說(shuō)明PCT基因片段(348 bp)成功插入p TG19-T載體,未出現(xiàn)堿基突變。用Bam H I和HindⅢ對(duì)重組表達(dá)載體PCT/p ET-22b(+)酶切,得到約350 bp和5 500 bp片段。超聲波破碎菌體后,SDS-PAGE電泳顯示PCT重組蛋白以可溶性形式存在,Mr約14KD,經(jīng)鎳柱親和層析法純化后即可獲得。Western blotting和PCT膠體金法結(jié)果呈陽(yáng)性,顯示重組蛋白含組氨酸標(biāo)簽(His-tag),并能與PCT抗體反應(yīng)。對(duì)不同表達(dá)條件下的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示:誘導(dǎo)時(shí)間12~20h、誘導(dǎo)劑終濃度為0.2~1.0 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為22℃、轉(zhuǎn)速為80~160r/min時(shí),上清液中PCT蛋白表達(dá)量較高。用PCT重組蛋白免疫Balb/c小鼠,第三次免疫7天后血清抗體效價(jià)均1:512 000。血液標(biāo)本在保存過(guò)程中,PCT會(huì)出現(xiàn)下降。25℃下血漿管放置4h(下降4.1%)和全血管放置2h(下降5.4%),在4℃下血漿管放置4h和全血管放置2h后,PCT檢測(cè)值之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在小牛血清中PCT重組蛋白4℃可保存20d,結(jié)果不變,顯著優(yōu)于生理鹽水和PBS。結(jié)論:成功構(gòu)建PCT/p TG19-T重組克隆載體和PCT/p ET-22b(+)重組表達(dá)載體,PCT重組蛋白以可溶性形式存在,經(jīng)鎳柱親和層析法純化后即可獲得。最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件:22℃、IPTG濃度0.2 mmol/L、12h和160 r/min。PCT重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性,易獲得高效價(jià)PCT鼠源性多克隆抗體。PCT檢測(cè)血液標(biāo)本保存不要超過(guò)4h,最好在2h內(nèi)檢測(cè),小牛血清是儲(chǔ)存PCT重組蛋白的首選介質(zhì)。
[Abstract]:Objective: to express human procalcitonin PCT gene in vitro and obtain high purity PCT recombinant protein. The expression conditions of PCT recombinant protein were optimized. Preparation of murine polyclonal antibody; The main influencing factors of clinical PCT detection and the optimal storage medium of PCT recombinant protein were analyzed. Methods: according to the gene sequence of human procalcitonin on NCBI. The full-length sequence was amplified by Primer Premier 5.0 primer and amplified by DNA gel recovery, plasmid extraction, gene linkage and restriction endonuclease identification. A prokaryotic expression vector PCT/p ET-22b was constructed. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 and induced to express. The induction time was 4 h ~ (8) h ~ (12) h ~ (12) ~ (16) h ~ (-1) ~ 20 h ~ (-1), and the induction temperature was 22 鈩，

本文編號(hào)：1399026