本文關(guān)鍵詞：基于細胞生物色譜法的苦碟子注射液保護缺氧損傷內(nèi)皮細胞的效應(yīng)成分研究　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目前,作為社會多發(fā)性疾病之一的心腦血管疾病已嚴(yán)重影響到了人類的生活質(zhì)量�？嗟幼⑸湟涸谥委熢擃惣膊》矫婢哂休^好的療效,已廣泛應(yīng)用于臨床。但是,苦碟子注射液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確,制約了其臨床安全用藥研究。傳統(tǒng)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究通常會耗費大量的時間在非有效成分或無效成分的分離提取與結(jié)構(gòu)鑒定上,在分離提取過程中也會導(dǎo)致活性成分或有效成分的丟失。針對上述問題,相關(guān)研究者引入了以活性為導(dǎo)向的中藥化學(xué)成分研究方法。本課題首次應(yīng)用細胞生物色譜法對臨床常用中藥苦碟子注射液治療腦缺血性疾病的藥效成分進行研究:選擇人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)作為靶細胞,使苦碟子注射液中的活性成分與靶細胞特異性結(jié)合,經(jīng)細胞靶點脫敏失活后,再從細胞中釋放出被結(jié)合的活性成分,并應(yīng)用LC-MS快速鑒定靶向親和的化學(xué)成分,得到候選的活性成分;最后結(jié)合體外藥效學(xué)實驗以及相關(guān)文獻查閱以對其活性進行驗證。本研究可快速有效地篩選苦碟子注射液治療腦缺血性疾病的藥效成分。同時,通過建立HUVEC體外培養(yǎng)體系及模擬腦血管內(nèi)皮細胞缺氧損傷模型,可為體外腦缺血性疾病藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一種快捷、有效的方法學(xué)借鑒。目的應(yīng)用UHPLC-HR-MSn技術(shù)分析檢測苦碟子注射液中原型成分及其在大鼠血漿中的移行成分;應(yīng)用細胞生物色譜法及UHPLC-LTQ-Orbitrap質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速篩選鑒定苦碟子注射液中治療腦缺血性疾病的候選活性成分;通過體外實驗,對苦碟子注射液治療腦缺血性疾病的候選活性成分進行藥效學(xué)研究。方法1.尾靜脈注射苦碟子注射液后,收集給藥前后的大鼠血漿,經(jīng)固相萃取法處理后,采用色譜柱 ACQUITYUPLCBEHC18(1.7μm,2.1×100mm)和 0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫;應(yīng)用LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀在負離子模式檢測苦碟子注射液中的化學(xué)成分以及血漿樣品中的原型成分和代謝產(chǎn)物。2.選擇HUVECs作為靶細胞,先使苦碟子注射液中的活性成分與靶細胞特異性結(jié)合,經(jīng)細胞靶點脫敏失活后,應(yīng)用LC-MS快速鑒定與細胞靶向親和的化學(xué)成分,從而篩選得到苦碟子注射液治療腦缺血性疾病的候選活性成分。3.建立Na2S2O4誘導(dǎo)的HUVECs缺氧損傷模型,并給予不同濃度NaHS及候選活性成分進行干預(yù)。經(jīng)CCK-8試劑盒(CCK-8)檢測不同濃度藥物干預(yù)后的細胞活力,從而確定候選活性成分的給藥濃度以及初步判斷其藥效作用。檢測HUVECs在缺氧損傷后細胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、細胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(LDH)漏出率及通過文獻查閱對候選活性成分的藥效作用進行探討。結(jié)果1.根據(jù)精確分子量數(shù)據(jù)和多級質(zhì)譜碎片,結(jié)合對照品比對,從苦碟子注射液中分析鑒定了 53個成分,包括18個有機酸、15個黃酮、18個倍半萜內(nèi)酯、2個核苷;從大鼠血漿中分析檢測到38個原型及代謝產(chǎn)物,其主要代謝途徑為甲基化、羥基化、水解、葡萄糖酸酸化及它們的復(fù)合反應(yīng)等。2.根據(jù)獲得的精確分子量數(shù)據(jù)、保留時間以及結(jié)合苦碟子注射液中的成分進行鑒定歸屬,從細胞裂解液中共篩選鑒定出9個化學(xué)成分,其中包括有機酸類成分3個、黃酮類成分2個及倍半萜內(nèi)酯類成分4個;其中,與細胞靶向親和的化學(xué)成分均包含在入血成分內(nèi)。3.在一定濃度范圍內(nèi),NaHS、綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及11,13α-dihydroixerin Z可以使缺氧HUVECs的細胞活力明顯增強、SOD活性明顯升高而LDH漏出率明顯降低(P0.01或P0.05)。對于另外6個未進行活性驗證的單體化合物則通過相關(guān)文獻查閱,表明大多數(shù)候選活性成分的確具有一定的藥理活性。結(jié)論1.應(yīng)用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)較為全面地闡明了苦碟子注射液化學(xué)成分及其在大鼠血漿中的移行成分,可為下一步苦碟子注射液與靶細胞結(jié)合成分的鑒定提供基礎(chǔ)。通過對苦碟子注射液入血成分進行分析鑒定,可為苦碟子注射液藥理、藥效研究以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。2.應(yīng)用細胞生物色譜法與UHPLC-LTQ-Orbitrap質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速篩選鑒定苦碟子注射液治療腦缺血性疾病的候選藥效成分,為體外腦缺血性疾病藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一種快捷、有效的方法學(xué)借鑒。3.通過建立HUVECs體外培養(yǎng)體系及模擬血管內(nèi)皮細胞缺氧損傷模型,可為腦缺血性疾病體外研究提供一種簡便、可靠的方法。通過體內(nèi)動物實驗、體外藥效學(xué)實驗以及對候選活性成分的藥理活性進行文獻查閱,進一步驗證了細胞生物色譜法篩選中藥中活性成分的方法是有效的,為研究苦碟子注射液藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。同時,為復(fù)雜體系中藥的藥效物基礎(chǔ)研究提供了思路。
[Abstract]:A rapid and effective method for the treatment of cerebral ischemia diseases is studied by means of HPLC and UHPLC - LTQ - Orbitrap mass spectrometry . A simple and reliable method for the determination of the active components in the rat plasma by HPLC and UHPLC - LTQ - Orbitrap mass spectrometry is provided .

【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R286.0

【參考文獻】

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1 張亞洲;王濤;鄒樹良;劉海林;晏晨;;芹菜素在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定與分析[J];中國藥房;2016年04期

2 劉榮榮;劉穎;張加余;李云;張秀平;劉思q，

本文編號：1397273