發(fā)布時(shí)間：2018-01-08 04:03

  本文關(guān)鍵詞：頭部淺低溫對(duì)大鼠腦缺血再灌注海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)及細(xì)胞外谷氨酸濃度的影響　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)采用改良的Pulsinelli四血管阻斷(4-Vessel occlusion,4VO)法制備大鼠全腦缺血再灌注模型,鼻咽腔降溫法維持頭部淺低溫,微透析技術(shù)收集大鼠海馬CA1區(qū)微透析液并測(cè)定其中谷氨酸(Glutamic acid,Glu)濃度([Glu]e),比較在頭部淺低溫條件下應(yīng)用谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glutamate transporter 1,GLT-1)特異性抑制劑二氫卡因酸鹽(Dihydrokainate,DHK)或應(yīng)用PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002后,對(duì)海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá)及細(xì)胞外谷氨酸濃度影響,評(píng)價(jià)磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號(hào)通路調(diào)控GLT-1表達(dá)在腦缺血再灌注損傷中的影響,為治療性低溫在臨床應(yīng)用提供參考。方法:1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠30只(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分配為5組(n=6):假手術(shù)組(Sham組/S組)、常溫缺血再灌注組(IN組)、低溫缺血再灌注組(IH組)、GLT-1特異性抑制劑組(DHK組)、PI3K/Akt信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002組(LY組)。2動(dòng)物模型制備采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法(4-Vessel occlusion,4VO)制備全腦缺血再灌注模型,鼻咽腔降溫法制備頭部淺低溫模型。(1)假手術(shù)組(Sham組/S組)(n=6):僅暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈但不燒灼,僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不夾閉。(2)常溫缺血/再灌注組(IN組)(n=6):永久熱凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48小時(shí)后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈穿線并夾閉雙側(cè)8 min恢復(fù)灌注。(3)低溫缺血再灌注組(IH組)(n=6):永久熱凝閉大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈,48小時(shí)后分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈穿線備用,鼻咽腔降溫法持續(xù)低溫,維持海馬溫度(33.0±0.5)℃,夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min后復(fù)灌。(4)GLT-1特異性抑制劑組(DHK組)(n=6):永久熱凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48小時(shí)后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,鼻咽腔降溫至目標(biāo)溫度持續(xù)收集細(xì)胞外液,夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈前30 min,右側(cè)腦室緩慢注射DHK溶液20μl(200nmol),夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min復(fù)灌。(5)LY294002組(LY組)(n=6):永久熱凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,48小時(shí)后暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈前20 min,右側(cè)腦室緩慢注射5μl LY294002(LY294002溶于DMSO中,濃度為25mmol/L),夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8 min復(fù)灌。以上各組均須同時(shí)監(jiān)測(cè)直腸溫度,并維持其在(37±0.5)℃。3標(biāo)本采集及檢測(cè)方法3.1微透析液的收集時(shí)間及測(cè)定大鼠全腦缺血前20min~10min,記為t0;全腦缺血前10min~缺血前,記為t1;缺血即刻~10min,記為t2;缺血后10min~20min,記為t3;缺血后20min~30min,記為t4;缺血后30min~40min,記為t5。收集各組大鼠微透析液并密封保存于-80℃冰箱,應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在不同濃度的峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,從而得出微透析液中谷氨酸濃度([Glu]e)變化。3.2免疫組化測(cè)定海馬CA1區(qū)Bax、Bcl-2、p Akt和GLT-1蛋白表達(dá)各組大鼠微透析液收集完成后,繼續(xù)維持頭部淺低溫(33±0.5)℃,直腸溫度維持在(37±0.5)℃,待2小時(shí)后自然復(fù)溫。各組大鼠于缺血再灌注8 h斷頭取腦,使用4%多聚甲醛固定腦組織,應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察Bax、Bcl-2、GLT-1和p Akt蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1大鼠海馬CA1區(qū)[Glu]e比較與t0比較,各組t1、t5[Glu]e均無(wú)明顯改變(P0.05),t2、t3、t4[Glu]e差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。t2時(shí),IN組、DHK組、LY組[Glu]e明顯高于S組與IH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);t3時(shí),DHK組與LY組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),S組、IH組、DHK組、LY組[Glu]e均低于IN組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);t4時(shí),DHK、LY組高于Sham組[Glu]e,IH組[Glu]e低于LY組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2各組大鼠海馬CA1區(qū)Bax、Bcl-2表達(dá)的免疫組化比較與S組比較,IN組、DHK組、LY組Bax表上達(dá)調(diào),Bcl-2表達(dá)下調(diào),IH組Bcl-2表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與IN組相比,IH組、DHK組、LY組Bax表達(dá)下調(diào),Bcl-2表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與IH組相比,DHK組、LY組Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DHK組、LY組兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3各組大鼠海馬CA1區(qū)p Akt蛋白表達(dá)的免疫組化比較與S組比較,IN組、LY組p Akt表達(dá)下調(diào),IH組、DHK組p Akt表達(dá)上調(diào)(P0.05);與IN組相比,IH組、DHK組p Akt蛋白表達(dá)上調(diào),LY組p Akt表達(dá)下調(diào)(P0.05);與IH組相比,DHK組、LY組p Akt表達(dá)下調(diào)(P0.05);與DHK組相比,LY組p Akt表達(dá)下調(diào)(P0.05)。4各組大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白表達(dá)的免疫組化比較海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GLT-1蛋白均有表達(dá)。S組有少量棕黃色GLT-1蛋白陽(yáng)性免疫顆粒。與S組比較,IN組GLT-1表達(dá)下調(diào),IH組、DHK組GLT-1表達(dá)上調(diào)(P0.05);與IN組相比,IH組、DHK組、LY組GLT-1表達(dá)上調(diào)(P0.05);與IH組相比,DHK組、LY組GLT-1表達(dá)下調(diào)(P0.05);與DHK組相比,LY組GLT-1表達(dá)下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:1頭部淺低溫可有效減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷。2頭部淺低溫通過(guò)上調(diào)海馬CA1區(qū)GLT-1表達(dá),降低細(xì)胞外谷氨酸濃度,減輕其興奮性毒性作用,從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。
[Abstract]:Objective : To evaluate the effect of modified Pulsinelli 4 - vessel occlusion ( 4VO ) method on the expression of GLT - 1 and Glu in the CA1 region of rats . ( 4 ) GLT - 1 specific inhibitor group ( DHK group ) ( n = 6 ) : After 48 hours , bilateral common carotid artery was isolated . ( 5 ) The expression of Bax , Bcl - 2 , GLT - 1 and GLT - 1 protein in hippocampus CA1 region was measured by high performance liquid chromatography ( HPLC ) . The expression of Bax and Bcl - 2 in the hippocampal CA1 region of the rats was lower than that in the sham group ( P0.05 ) . Compared with the group in the group , the expression of Bax and Bcl - 2 in the CA1 region of the group was significantly higher than that in the sham group ( P0.05 ) . The expression of GLT - 1 in the CA1 region of hippocampus was downregulated ( P0.05 ) . Compared with the group , the expression of GLT - 1 in the CA1 region of the hippocampus was down - regulated ( P0.05 ) . Compared with the group of the group , the expression of GLT - 1 in the CA1 region of the hippocampus was down - regulated ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R614

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1395514