發(fā)布時(shí)間：2018-01-07 14:16

  本文關(guān)鍵詞：TGF-β及其受體信號(hào)通路在氟調(diào)控破骨細(xì)胞分化中的作用　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 氟骨癥 成骨細(xì)胞 破骨細(xì)胞 TGF-β SB431542

【摘要】：研究背景:轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)作為轉(zhuǎn)化生長因子超家族中的多功能細(xì)胞因子,其產(chǎn)生于細(xì)胞分化的各個(gè)階段,在骨組織中的含量尤為豐富。TGF-β可以由骨中的許多細(xì)胞產(chǎn)生并分泌在骨基質(zhì)中,研究證明了TGF-β在破骨細(xì)胞的分化和骨的重吸收過程中發(fā)揮重要的作用。在氟骨癥發(fā)病過程中,氟能夠刺激成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞,均表現(xiàn)出不同程度的活躍性,但是對(duì)于在骨的重吸收過程中發(fā)揮主要作用的破骨細(xì)胞研究甚少。本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)、體外兩個(gè)方面進(jìn)行研究,探究TGF-β在氟調(diào)控的破骨細(xì)胞中的作用,這在以往的氟骨癥機(jī)制研究中罕見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究成果將為氟骨癥及相關(guān)代謝性骨病的研究提供線索和理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方案:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):60只清潔級(jí)雄性成年Wistar大鼠平均分為對(duì)照組、低氟組和高氟組。三組大鼠給予氟處理1個(gè)月后,每組中選取一半的大鼠進(jìn)行SB431542試劑處理,實(shí)驗(yàn)最后分為6組:對(duì)照組,10mg F-/kg·day組,20mg F-/kg·day組,SB431542組,10mg F-/kg·day+SB431542組,20mg F-/kg·day+SB431542組。投氟聯(lián)合SB431542繼續(xù)處理1個(gè)月后,乙醚麻醉處死大鼠,經(jīng)眼球取血進(jìn)行生化分析,收集股骨、脛骨等骨組織進(jìn)行HE染色、免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析。我們主要觀察了氟中毒大鼠骨組織的病理形態(tài)、骨保護(hù)素蛋白表達(dá)以及成骨、破骨標(biāo)志物水平。該實(shí)驗(yàn)主要考察氟中毒大鼠復(fù)制氟骨癥模型、骨轉(zhuǎn)換特征和TGF-β受體抑制劑對(duì)氟骨癥骨吸收病理過程的影響。2.體外實(shí)驗(yàn):我們以小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7為研究對(duì)象,采用培養(yǎng)基加RANKL(25ng/m L)誘導(dǎo)單核細(xì)胞融合成破骨細(xì)胞前體,作為考察氟誘導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖和分化的體外模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)為對(duì)照組,1、4、16mg F-/m L三個(gè)梯度氟組以及SB431542組和三個(gè)梯度氟聯(lián)合SB431542組,共8組。RAW264.7細(xì)胞在RANKL存在的條件下,分別給予氟濃度分別為0,1,4,16 mg F-/m L,以及氟聯(lián)合抑制劑SB431542(濃度為10μmol/L)進(jìn)行處理,培養(yǎng)7天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。采用MTT法檢測不同條件下的細(xì)胞活性;將RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞接種在骨磨片上,培養(yǎng)7天后,對(duì)骨片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色,光鏡下觀察各組形成骨陷窩的形態(tài)并進(jìn)行不同條件下破骨細(xì)胞樣細(xì)胞骨吸收能力的比較分析;利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白雜交技術(shù)分別檢測了暴露于不同條件下RAW264.7細(xì)胞內(nèi)破骨相關(guān)及TGF-β信號(hào)通路各因子在基因和蛋白水平的表達(dá)變化。3.mi RNA表達(dá)分析:RAW264.7細(xì)胞在RANKL存在的條件下,給予氟濃度8mg F-/L培養(yǎng)液處理7天。采用Affymetrix mi RNA 4.0芯片進(jìn)行染氟組與對(duì)照組細(xì)胞mi RNA表達(dá)譜分析,利用Volcano Plot filtering觀察mi RNA基因表達(dá)量的變化,與對(duì)照組比較倍數(shù)改變值≥2.0或≤-2.0即為明顯差異表達(dá)的mi RNA。最后用層次聚類法分析明顯差異基因的表達(dá)框架。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):投氟大鼠隨著投氟時(shí)間延長和投氟量的加大,氟斑牙病損和骨轉(zhuǎn)換活躍狀態(tài)更加顯著。SB431542聯(lián)合氟處理組大鼠的氟斑牙損害程度比相同投氟條件下大鼠牙齒損害加重,但是骨組織病理性骨轉(zhuǎn)換特征被抑制。與之相對(duì)應(yīng)的是氟能夠促進(jìn)大鼠血清內(nèi)PINP和CTX的濃度提高,而單獨(dú)SB431542處理顯著抑制了兩者的表達(dá);氟降低了大鼠的骨密度,而且高氟組大鼠明顯比低氟組大鼠骨密度低,骨密度變化情況與前面的病理結(jié)果相互支持。此外,大鼠骨組織抑制破骨關(guān)鍵因子OPG蛋白表達(dá)明顯降低,SB431542促進(jìn)骨髓B細(xì)胞前體表達(dá)OPG。大鼠暴露于不同氟水平能夠引起活躍骨轉(zhuǎn)換,造成不同程度的成骨和破骨活動(dòng)加強(qiáng)。SB431542作為TGF-β1細(xì)胞內(nèi)受體抑制劑能夠抑制骨轉(zhuǎn)換,明顯影響氟引起的骨轉(zhuǎn)換狀態(tài),說明TGF-β1在氟刺激的骨轉(zhuǎn)換機(jī)制中扮演著重要角色。2.體外實(shí)驗(yàn):結(jié)果表明低量氟顯著刺激RAW264.7細(xì)胞活性,高量氟早期也能促進(jìn)該細(xì)胞活性,但是隨著氟作用時(shí)間的延長,細(xì)胞活性受到抑制。同樣地,低量氟對(duì)RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞骨吸收能力和破骨細(xì)胞分化特征的細(xì)胞數(shù)具有顯著的刺激作用,高氟卻抑制這種作用。經(jīng)過破骨細(xì)胞分化標(biāo)志物TRAP和調(diào)控因子RANK表達(dá)在染氟破骨細(xì)胞樣細(xì)胞內(nèi)的變化,證明了氟對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的刺激作用,并且伴隨著TGF-β1細(xì)胞內(nèi)兩個(gè)受體及其下游磷酸化Smad3的表達(dá)。然而,氟對(duì)破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的刺激作用在聯(lián)合給予TGF-β1細(xì)胞內(nèi)受體抑制劑SB431542后顯著下降;相應(yīng)地,磷酸化Smad3和TβR1的表達(dá)比單獨(dú)氟作用組細(xì)胞明顯降低。這些結(jié)果提示了TGF-β1在氟作用破骨細(xì)胞分化和功能機(jī)制中有著重要作用。3.mi RNA芯片分析:結(jié)果顯示出染氟能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞內(nèi)的誘導(dǎo)細(xì)胞分化及參與調(diào)控的IGF1和TGF-β1等的mi RNA表達(dá)顯著增加。我們知道每個(gè)mi RNA可以有多個(gè)靶基因,而幾個(gè)mi RNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。在本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)了氟刺激了多個(gè)參與調(diào)控破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路,如IGF1和TGF-β1及其細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)因子Smad3、MAPK等的mi RNA變化。結(jié)論:低量氟對(duì)破骨細(xì)胞活性、分化和功能具有顯著的刺激作用,高氟作用一定時(shí)間后卻能抑制這種刺激作用,并阻礙破骨細(xì)胞的分化和功能。TGF-β1在氟作用破骨細(xì)胞分化和功能機(jī)制中有著重要作用,氟很可能通過TGF-β1細(xì)胞內(nèi)的TβR1-磷酸化Smad3信號(hào)通路發(fā)揮這種刺激作用。同時(shí),氟可以同時(shí)刺激破骨細(xì)胞內(nèi)多個(gè)參與調(diào)控破骨細(xì)胞分化信號(hào)通路,如IGF1和TGF-β1及其細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)因子Smad3、MAPK等的mi RNA變化,這為我們下一步分析氟誘導(dǎo)破骨精細(xì)調(diào)控機(jī)制提供了線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R599.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 牟蔚平;顏虹;張聯(lián)合;;氟骨癥的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];中外醫(yī)學(xué)研究;2011年32期

2 張勇;秦娜;于斌;;TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

3 歐三桃;黃頌敏;;骨保護(hù)素與血管鈣化[J];醫(yī)學(xué)綜述;2007年14期

4 鄭照霞;梁寶宏;倪鳳偉;;國內(nèi)外地方性氟骨癥治療研究進(jìn)展[J];中國地方病防治雜志;2007年03期

5 孫強(qiáng);邱勇;;轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[J];江蘇醫(yī)藥;2006年07期

6 范中學(xué),李平安,劉曉莉,李曉茜;骨苓通痹丸治療1500例氟骨癥療效觀察[J];地方病通報(bào);2005年03期

7 肖新華;周后德;王運(yùn)林;張紅;袁凌青;胡平安;楊雅;何玉玲;隋國良;翟木緒;王敏;廖二元;;RANKL誘導(dǎo)小鼠單核細(xì)胞RAW264．7分化成成熟破骨細(xì)胞[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2005年02期

8 胡志娟,李英;TGF-β/Smad信號(hào)通路與腎臟疾病的研究進(jìn)展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志;2005年01期

9 趙志德,寇伯君,李勝文,李玉林,魯學(xué)軍,韓英杰;腎癌患者TGF-β_1表達(dá)和腫瘤微血管密度檢測的臨床意義[J];中華泌尿外科雜志;1999年06期

10 李廣生,任立群;不同鈣含量飼養(yǎng)條件下氟中毒對(duì)大鼠骨轉(zhuǎn)換的影響[J];中華病理學(xué)雜志;1997年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 王瑩;氟作用條件下PTH、PTH-rp、CaSR表達(dá)變化及在氟骨癥發(fā)生機(jī)制中的作用[D];吉林大學(xué);2015年

2 李希寧;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PERK信號(hào)通路在氟骨癥發(fā)病機(jī)制中的作用[D];吉林大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：1392901