本文關鍵詞：氧化低密度脂蛋白刺激下的巨噬細胞中YY1和STAT1對microRNA-29a的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用　出處：《浙江大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景及目標:以動脈粥樣硬化為病理基礎的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及其并發(fā)癥如血栓栓塞,乳頭肌功能失調(diào)和心臟破裂對全世界人類健康造成了嚴重的威脅,然而其發(fā)病機制至今尚未完全闡明。在動脈粥樣斑塊的形成過程中涉及多種細胞的參與,如血管內(nèi)皮細胞,血管平滑肌細胞和單核巨噬細胞等。其中,單核細胞在血液中可以分化成為巨噬細胞,而巨噬細胞在ox-LDL的刺激下可以攝取脂質(zhì),分泌炎性細胞因子或與其他細胞相互作用,在多種因素相互作用下最終導致動脈粥樣斑塊的形成。已有大量文獻報道m(xù)iRNAs參與包括冠心病在內(nèi)的多種心血管疾病的病理生理過程,研究結(jié)果表明在miRNAs調(diào)控下單核巨噬細胞功能的改變也是冠心病發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。MiR-29a參與炎癥免疫,糖代謝及細胞外基質(zhì)形成等多種生理過程。近期研究發(fā)現(xiàn)miR-29a可調(diào)控巨噬細胞內(nèi)與凋亡及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運相關的基因表達從而影響腫瘤的發(fā)生。而我們之前研究也發(fā)現(xiàn)在ox-LDL刺激樹突狀細胞后,miR-29a不僅表達增加,還可引起清道夫受體SRA及CD36表達上調(diào)。然而,miR-29a在ox-LDL刺激后的巨噬細胞中的效應及作用機制仍未知。故本研究目的主要在于探索miR-29a在ox-LDL刺激下的巨噬細胞中表達的變化,及其對巨噬細胞功能的影響和相關作用機制。研究方法:本實驗采用PMA處理后THP-1細胞分化成的巨噬細胞作為開展本研究的主要細胞。經(jīng)過ox-LDL刺激后,檢測miR-29a的表達情況。通過轉(zhuǎn)染siRNA對ox-LDL攝取過程中主要參與因素如清道夫受體SRA,LOX-1和CD36的表達量改變,觀察miR-29a的表達情況,以及下調(diào)miR-29a表達水平后觀察清道夫受體的表達。其次,通過雙熒光素酶報告檢測以及轉(zhuǎn)錄因子濾板法測定等方法確定參與miR-29a表達的轉(zhuǎn)錄因子。通過生物信息學分析,DNA瓊脂糖凝膠電泳,CHIP,細胞免疫共沉淀等研究轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控miR-29轉(zhuǎn)錄的機制。此外,我們還通過過表達miR-29a觀察巨噬細胞分泌的炎性細胞因子以及脂質(zhì)攝取的情況。結(jié)果:將THP-1成功分化巨噬細胞后,給予ox-LDL刺激后,觀察發(fā)現(xiàn)miR-29a的表達上升。抑制SRA和LOX-1,miR-29a的表達降低,而抑制CD36后miR-29a的表達水平?jīng)]有明顯變化。miR-29a可以促進上調(diào)SRA的表達,而抑制miR-29a后,SRA表達下降。通過雙熒光素酶報告檢測以及轉(zhuǎn)錄因子濾板法測定發(fā)現(xiàn)巨噬細胞內(nèi)miR-29a轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp的區(qū)域在經(jīng)過ox-LDL刺激后活性增強,而YY1和STAT1是與該區(qū)域結(jié)合的主要轉(zhuǎn)錄因子。分別抑制YY1和STAT1后發(fā)現(xiàn)miR-29a表達下降。生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)miR-29a的啟動子區(qū)域僅有YY1的結(jié)合位點,而無STAT1的結(jié)合位點,通過DNA凝膠電泳后證實YY1可與野生型的miR-29a結(jié)合,而與突變型不能結(jié)合。通過CHIP發(fā)現(xiàn)ox-LDL刺激后YY1與STAT1與啟動子結(jié)合增加,此外YY1和STAT1表達增加。通過免疫共沉淀顯示YY1和STAT1可相互結(jié)合并在細胞核內(nèi)定位增加。抑制JAK1/2激酶后,YY1和STAT1的表達下降且miR-29表達也下調(diào)。過表達mir-29a不僅引起炎性細胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α的分泌增多,而且促進巨噬細胞脂質(zhì)攝入,而抑制miR-29a后使IL-6和TNF-α的分泌及脂質(zhì)攝取減少。結(jié)論:ox-LDL刺激巨噬細胞后引起轉(zhuǎn)錄因子YY1及STAT1表達升高,通過YY1與STAT1結(jié)合后再與miR-29a的啟動子區(qū)域結(jié)合,從而促進miR-29a的轉(zhuǎn)錄,激活JAK1/2激酶也可與YY1與STAT1協(xié)同誘導miR-29a表達。此外,我們還發(fā)現(xiàn)mir-29a可正性調(diào)控炎性細胞因子分泌以及脂質(zhì)攝取增加。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of miR - 29a in the pathogenesis of coronary heart disease ( CHD ) induced by ox - LDL . The results show that miR - 29a can regulate the expression of miR - 29a in the course of the formation of ox - LDL . The results show that miR - 29a can regulate the expression of miR - 29a in the process of ox - LDL stimulation . In order to promote the transcription of miR - 29a , the expression of miR - 29a can also be induced in combination with YY1 and STAT1 . In addition , we find that mir - 29a can regulate inflammatory cytokine secretion and increase lipid intake .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R541.4

【參考文獻】

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1 唐慧;伍海姍;楊怡;趙靖平;陳晉東;;外泌體源性microRNA在疾病診療中的研究進展[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2015年11期

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本文編號：1381330