本文關(guān)鍵詞：活血化瘀中藥有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠胃平滑肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及JNK信號(hào)通路的影響　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:糖尿病胃輕癱(DGP)是以胃排空延遲為主要特點(diǎn)的癥候群。主要以上腹燒灼感、腹痛、惡心、嘔吐、餐后飽脹及早飽感為表現(xiàn)。糖尿病胃輕癱這一名詞在1958年首次被Ksaaander提出。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的變化,這種并發(fā)癥在全球范圍內(nèi)逐年遞增,據(jù)統(tǒng)計(jì),在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者中超過50%為DGP[1-2],嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后。目前國(guó)內(nèi)外研究表明DGP的發(fā)病機(jī)制主要為高血糖、自主神經(jīng)功能障礙、胃腸激素分泌異常、平滑肌損害、微血管病變、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)缺失以及代謝紊亂等。胃平滑肌細(xì)胞是胃腸運(yùn)動(dòng)最終的執(zhí)行者,DGP的發(fā)病機(jī)制中胃平滑肌損傷是胃動(dòng)力異常的最終環(huán)節(jié)。在一些超微結(jié)構(gòu)研究中可見DGP大鼠胃竇平滑肌細(xì)胞排列紊亂,且平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)大量溶解,在胃電活動(dòng)的研究中可見DGP大鼠胃平滑肌的收縮頻率及振幅下降,由于胃的舒縮功能與胃的機(jī)械運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切,這就導(dǎo)致了胃松弛性增加[3]。目前自噬在糖尿病并發(fā)癥中的研究較多,自噬即自我吞噬,它是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種細(xì)胞內(nèi)代謝降解的生命現(xiàn)象。自噬溶酶體是自噬的后期階段,它標(biāo)志著自噬的存在。自噬是一把雙刃劍,在生理狀態(tài)下,自噬可以清除胞內(nèi)功能損傷及衰老的細(xì)胞器,維持主要的合成代謝。但是,如果過度激活自噬則可以引起細(xì)胞內(nèi)大量必要分子和細(xì)胞器被分解,從而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)Ⅱ型程序性死亡。Beclin1及LC3是參與自噬的重要蛋白,Beclin1構(gòu)成了自噬的啟動(dòng)蛋白,LC3是自噬溶酶體膜的延伸的標(biāo)志性蛋白質(zhì)。JNK信號(hào)通路是介導(dǎo)自噬的一條重要通路,JNK信號(hào)通路主要是通過使Bcl-a家族蛋白磷酸化進(jìn)而上調(diào)自噬基因Beclin-1來促進(jìn)自噬發(fā)生。在糖尿病胰島素抵抗的研究中發(fā)現(xiàn)抑制JNK通路可下調(diào)自噬,進(jìn)而改善糖尿病胰島素抵抗[4-5]。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胃組織中可檢測(cè)到高表達(dá)的自噬蛋白,因此自噬的功能異常在DGP的發(fā)生、發(fā)展上起著重要的作用。但在高糖誘導(dǎo)的離體胃平滑肌細(xì)胞(GSMC)中是否存在過度自噬,是否與JNK信號(hào)通路有關(guān),尚未知。在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中由丹參、川芎、水蛭組成的活血化瘀中藥復(fù)方治療DGP上取得了良好的療效,之前的研究顯示活血化瘀通絡(luò)中藥可以通過促進(jìn)ICC活動(dòng)、調(diào)節(jié)胃腸激素分泌及修復(fù)胃血管內(nèi)皮等作用改善DGP胃排空障礙。但活血化瘀通絡(luò)中藥的治療機(jī)制沒有完全明確,本實(shí)驗(yàn)采用活血化瘀組方的有效成分,即丹參酮Ⅱ-A(TSN),川芎嗪(TMP)、水蛭素(Hirudin)共同干預(yù)由高糖誘導(dǎo)的大鼠胃平滑肌細(xì)胞,觀察其對(duì)GSMC自噬蛋白及其JNK通路表達(dá)的影響,研究活血化瘀中藥有效成分對(duì)平滑肌細(xì)胞收縮力的影響,以探討活血化瘀通絡(luò)中藥組方有效成分對(duì)DGP可能的作用機(jī)制。方法:1將大鼠胃平滑肌細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、高糖組、川芎嗪濃度梯度組、丹參酮Ⅱ-A濃度梯度組、水蛭素濃度梯度組,用MTT法檢測(cè)丹參酮Ⅱ-A,川芎嗪、水蛭素的最適藥物濃度。2實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(25mmol/l葡萄糖)、高糖組(40mmol/l葡萄糖)、中藥組(40mmol/l葡萄糖加中藥有效成分共孵育)、JNK抑制劑組(40mmol/l葡萄糖加20μmol/L SP600125共孵育),各個(gè)組分別給予藥物處理24小時(shí)。3各組應(yīng)用丫啶橙染色熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體。4各組細(xì)胞戊二醛固定后應(yīng)在倒置顯微鏡下用顯微尺測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)軸長(zhǎng)度,進(jìn)而測(cè)定細(xì)胞收縮力。5采用Western blot方法檢測(cè)LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、P-JNK蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1活血化瘀中藥組方有效成分對(duì)細(xì)胞收縮力的影響:測(cè)量各組大鼠平均細(xì)胞長(zhǎng)度,與正常對(duì)照(47.13±8.98μm)組比較,高糖組(62.63±4.44μm)大鼠GSMC明顯舒張,GSMC的平均長(zhǎng)度顯著增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),中藥組(51.21±6.99μm)及JNK抑制劑(49.79±6.18μm)組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與高糖組比較,中藥組大鼠GSMC有較明顯的收縮,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),JNK抑制劑組(49.79±6.18μm)大鼠GSMC明顯的收縮,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。與JNK抑制劑組比較,中藥組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。提示活血化瘀中藥組方有效成分可以促進(jìn)胃平滑肌細(xì)胞收縮,可能通過抑制JNK通路發(fā)揮作用。2活血化瘀中藥組方有效成分對(duì)GSMC自噬溶酶體的影響:倒置顯微鏡下可見正常組細(xì)胞呈綠色熒光,與正常對(duì)照組相比,高糖組GSMC胞質(zhì)中亮桔紅色點(diǎn)狀熒光明顯增加。與高糖組相比,中藥組亮桔紅色點(diǎn)狀熒光減少,JNK抑制劑組,紅色熒光也明顯減少。提示高糖可以誘導(dǎo)GSMC過度自噬,而活血化瘀中藥組方有效成分可以抑制自噬溶酶體的生成,下調(diào)高糖造成的細(xì)胞過度自噬從而減少細(xì)胞損傷,保證細(xì)胞正常的舒縮功能。這可能為其治療DGP胃動(dòng)力障礙的機(jī)制之一。3活血化瘀中藥組方有效成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的GSMC細(xì)胞Beclin1和LC3蛋白及JNK磷酸化的影響:結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較,經(jīng)高糖處理后LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)顯著增加(P0.05),與高糖組比較,中藥組及JNK抑制劑組LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)顯著減輕(P0.05),而正常對(duì)照組、中藥組及JNK抑制劑組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。提示高糖上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1及JNK相關(guān)蛋白JNK、p-JNK,誘導(dǎo)自噬過度增加,可能是通過激活JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)GSMC的自噬。而活血化瘀中藥組方有效成分抑制JNK通路下調(diào)細(xì)胞過度自噬從而減少細(xì)胞損傷,這可能為其治療DGP胃動(dòng)力障礙的機(jī)制之一。結(jié)論:1采用組織貼塊法,經(jīng)免疫組化鑒定,成功獲得大鼠GSMC。2高糖培養(yǎng)的GSMC存在細(xì)胞收縮力下降,高糖可能通過激活JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)GSMC的自噬。3活血化瘀中藥組方有效成可明顯改善GSMC收縮力,可能與其通過下調(diào)LC3-Ⅱ、Beclin-1自噬蛋白及JNK、p-JNK通路蛋白表達(dá)而抑制GSMC過度自噬有關(guān)。此可能為活血化瘀中藥組方有效成治療DGP的機(jī)制之一。
[Abstract]:Objective : To study the effect of DGP on gastric smooth muscle cells in patients with type 鈪，

本文編號(hào)：1381266