本文關(guān)鍵詞：基于高通量測序技術(shù)的枯草芽孢桿菌在體動態(tài)變化研究　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景腸道菌群在腸穩(wěn)態(tài)維持和腸易激綜合征(IBS)等多種疾病的發(fā)病機制中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)腹瀉性IBS患者短期應(yīng)用益生菌治療可以調(diào)節(jié)異常的小腸粘膜的屏障功能,改善患者的腹痛和腹脹癥狀,并降低患者的總IBS癥狀評分。然而益生菌攝入后如何在腸道內(nèi)定植以及如何影響腸道微生態(tài)尚不清楚。本實驗設(shè)計并構(gòu)建了"示蹤基因",并應(yīng)用16SrDNA高通量測序技術(shù)定量分析益生菌和腸道菌群的動態(tài)變化。目前對腸道微生物群的研究多應(yīng)用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù),如實時熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳DGGE,這些方法具有一定的局限性。而Illumina高通量測序技術(shù)能夠測序腸道中所有微生物DNA序列,全面分析腸道微生物落的多樣性和豐度,滿足對腸道微生物群落的全面認識。本實驗采用高通量測序方法探究益生菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在體內(nèi)的動態(tài)變化及其對腸道微生物群豐度和多樣性的影響,并將高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)的生物學(xué)技術(shù)——實時熒光定量PCR進行比較,進一步證實該技術(shù)在定量示蹤益生菌時的優(yōu)越性。目的探討枯草芽孢桿菌在腸道內(nèi)的定植情況及其服用時間長短對小鼠腸道菌群的影響。方法1.構(gòu)建示蹤基因:定量探究益生菌攝入后在腸道中的動態(tài)變化。為將攝入的益生菌與腸道固有菌群區(qū)分,本實驗中動物實驗部分使用的B.subtilis擴增細菌16S rRNA 的 338-806 區(qū)域,上下游引物分別為 338F-5' ACTCCTACGGGAGGCAGCA,806R-5' GGACTACHVGGGTWTCTAAT。經(jīng)此示蹤基因標記的益生菌在16SrDNA測序過程中會得到獨有的循環(huán)序列,其豐度代表攝入干預(yù)益生菌B.subtilis的量,以此定量示蹤益生菌在體內(nèi)的動態(tài)變化。2.動物實驗:18只C57BL/6J小鼠隨機分成三組(n=6),分別為對照組(C組),兩天組(TW組)和十天組(TE組),C組從第0天到第9天以0.9%生理鹽水2 ml每天灌胃。TW組在第0天至第1天以B.subtilis 109 CFU/ml菌體懸液2 ml每天灌胃,第2天至第9天則以0.9%生理鹽水2 ml每天灌胃。TE組從第0天至第9天以B.subtilis 109CFU/ml菌體懸液2 ml每天灌胃。三組小鼠均分別在第0天、第4天、第8天、第12天、第16天和第20天收集糞便并保存于-80℃冰箱。提取DNA后通過Illumina Miseq高通量測序平臺測序,分析腸道菌群中各種門、屬細菌的相對豐度及其變化規(guī)律,同時分析測序結(jié)果中示蹤基因的相對豐度及其變化規(guī)律,代表攝入后益生菌的數(shù)量動態(tài)變化,探究腸道微生態(tài)環(huán)境對益生菌的作用規(guī)律。同時進行16SrDNA熒光定量PCR,將高通量測序和定量PCR兩種方法的結(jié)果進行比較。結(jié)果1.灌胃后TW組和TE組的芽孢桿菌屬微生物相對豐度與灌胃前相比下降。2.各組內(nèi)腸道菌群相對豐度隨時間變化規(guī)律為:厚壁菌門和擬桿菌的變化規(guī)律不明顯,在益生菌灌胃的過程中呈反復(fù)波動的趨勢,在第20天時穩(wěn)定在十天組和兩天組較對照組的厚壁菌門相對豐度更高;隨著時間的變化兩天組和十天組內(nèi)變形菌門的相對豐度較實驗組更低;疣微菌門出現(xiàn)了顯著的而有規(guī)律性的變化:在第4天時TW組內(nèi)的疣微菌門相對豐度開始較C組更高,但較TE組更低,其后隨著時間變化一直穩(wěn)定這種趨勢,在第16天時出現(xiàn)短暫的高于TE組,但在第20天時相對豐度回落。而TE組內(nèi)的疣微菌門相對豐度始終高于C組和TW組。3.TE組在除了第0天的各個時間點上小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相似,而TW組在這各個時間點的腸道菌群結(jié)構(gòu)有存在差異。在第20天時,TW組和TE組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相似。結(jié)論枯草芽孢桿菌并非通過定植,而是通過與腸道菌群相互作用使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的方式發(fā)揮益生功效;此外,長期服用該益生菌對腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變速度快于短期服用。
[Abstract]:Background intestinal microflora plays an important role in the pathogenesis of intestinal homeostasis and irritable bowel syndrome (IBS). It is found that short-term probiotics therapy can regulate abnormal intestinal mucosal barrier function, improve abdominal pain and abdominal distension symptoms, and reduce the total IBS symptom score of diarrhea patients with IBS. However, it is not clear how probiotics can be planted in the intestinal tract and how to affect the intestinal microflora after the intake of probiotics. In this experiment, the "tracer gene" was designed and constructed, and the dynamic changes of probiotics and intestinal flora were quantitatively analyzed by 16SrDNA high throughput sequencing technology. At present, the traditional molecular biology technology, such as real-time fluorescence quantitative PCR and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), have some limitations in the study of intestinal microflora. Illumina high throughput sequencing technology can sequence all the DNA sequences of intestinal microflora, analyze the diversity and abundance of intestinal microbes, and satisfy the overall understanding of intestinal microbial communities. This experiment using high-throughput sequencing method of Probiotic Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) in vivo and its dynamic changes of the intestinal microbiota abundance and diversity effects, and high-throughput sequencing technology and traditional biological technology -- comparison of real-time fluorescence quantitative PCR, further confirmed the superiority of this technique in the quantitative tracer of probiotics. Objective to investigate the effect of the colonization of Bacillus subtilis in intestinal tract and the effect of the length of taking time on the intestinal flora of mice. Method 1. the tracer gene was constructed: the quantitative exploration of the dynamic changes in the intestinal tract after the intake of probiotics. In order to distinguish the intake of probiotics from the intestinal flora, the 338-806 region of B.subtilis 16S rRNA was amplified in animal experiments. The upstream and downstream primers were 338F-5'ACTCCTACGGGAGGCAGCA, 806R-5' GGACTACHVGGGTWTCTAAT. The tracer gene labeled probiotics will get a unique cycle sequence in the process of 16SrDNA sequencing, and its abundance represents the amount of intervention probiotics B.subtilis, which can quantitatively trace the dynamic changes of probiotics in vivo. 2. animal experiment: 18 C57BL/6J mice were randomly divided into three groups (n=6), the control group (group C), the two day group (group TW) and the ten day group (TE group), C group from zeroth days to ninth days, 0.9% normal saline 2 ml daily gavage. TW group in zeroth to first days to B.subtilis 109 CFU/ml cell suspension 2 ml per day by gavage, second days to ninth days in 0.9% saline 2 ml per day by gavage. Group TE was intragastric from zeroth to ninth days with B.subtilis 109CFU/ml suspension 2 ml every day. The three groups of mice collected feces at zeroth, fourth, eighth, twelfth, sixteenth and twentieth days, respectively, and kept in the refrigerator at -80 C. After extracting DNA by Illumina Miseq sequencing platform sequencing, analysis of intestinal flora in all kinds of doors, the relative abundance of bacteria and its variation, and analysis of relative abundance of tracer gene sequencing results and its variation, represents the number of dynamic changes of probiotics, explore the role of intestinal microecology of probiotics. At the same time, 16SrDNA fluorescence quantitative PCR was carried out, and the results of high throughput sequencing and quantitative PCR two methods were compared. Results 1. after 1. gastric perfusion, the relative abundance of Bacillus in group TE and group TW decreased compared with that before gavage. 2. groups of intestinal flora changes with the relative abundance of time variation of Firmicutes and Bacteroidetes were not obvious, repeated fluctuations in the process of probiotics gavage, on the twentieth day in the relatively stable Firmicutes ten days group and two days group than in the control group more abundance high; with relative abundance of time variation of two days group and ten days group within the Proteobacteria was lower in experimental group; verrucomicrobia appear significant and regular changes: on the fourth day in TW group verrucomicrobia started relative abundance than C group is higher than TE, but group is lower, with the change of time has been stable following this trend, in sixteenth days was higher than that in group TE short, but in twentieth days when the relative abundance of fall. The relative abundance of verruca microphylum in group TE was always higher than that in group C and TW. In group 3.TE, the structure of intestinal flora in mice was similar at all time points except zeroth days, but there were differences in the structure of intestinal flora in group TW at all time points. At twentieth days, the structure of intestinal microflora in group TW and TE mice was similar. Conclusion Bacillus subtilis is not through colonization, but plays a prebiotic role by changing its structure through interaction with intestinal flora. Besides, long-term use of probiotics can change the structure of intestinal flora faster than short-term.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R57

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