發(fā)布時間：2017-12-25 04:31

  本文關(guān)鍵詞：染色體15q25區(qū)域常見遺傳變異與肺癌易感性的關(guān)聯(lián)研究　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 染色體15q25區(qū)域 捕獲測序 單核苷酸多態(tài)性 肺癌 吸煙

【摘要】：肺癌已成為危害人類健康最常見的惡性腫瘤之一。近年來,由于持續(xù)增長的煙草消費、環(huán)境污染以及生活方式的改變,我國肺癌的發(fā)病形勢日趨嚴(yán)峻。肺癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果,流行病學(xué)資料顯示吸煙是與肺癌發(fā)病風(fēng)險最為密切的環(huán)境危險因素,吸煙人群中罹患肺癌的風(fēng)險是非吸煙人群的20倍,90%以上的肺癌患者與煙草依賴或成癮行為有關(guān)。然而,在相同的煙草暴露下,不到20%的吸煙人群發(fā)展為肺癌,提示個體對肺癌遺傳易感性存在差異。2008年以來,已有多個全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies,GWAS)在多個種族人群中研究肺癌的遺傳易感性,發(fā)現(xiàn)了一批肺癌易感區(qū)域,如染色體5p15、6p21和15q25等。其中,在歐洲人群中進行的三項GWAS研究發(fā)現(xiàn)染色體15q25(CHRNA3-CHRNA5-CHRNB4 區(qū)域的遺傳變異與肺癌發(fā)病風(fēng)險存在顯著關(guān)聯(lián)。但是到目前為止,上述易感位點(rs8034191、rs16969968和rs1051730)在中國人群的研究中均未能得到驗證,原因可能是不同種族個體存在遺傳異質(zhì)性,表現(xiàn)為在中國人群中其最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency,MAF)均小于0.05;為了解析該區(qū)域在中國人群的遺傳結(jié)構(gòu),本課題組在中國人群中通過前期對15q25進行精細(xì)定位研究發(fā)現(xiàn)了 4個常見遺傳位點(MAF≥0.05),分別為 rs2036534、rs667282、rs12910984 和 rs6495309,其相同堿基的頻率在不同人群中差異很大,進一步說明肺癌易感基因位點的分布存在著種族和地域異質(zhì)性。此外,尼古丁基因家族成員CHRNA3-CHRNA5-CHRNB4(cholinergic receptor nicotinic α3,α5 and β4)編碼煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs),可影響個體的吸煙行為及煙草成癮;位于肺支氣管上皮細(xì)胞的受體可通過調(diào)控?zé)煵葜掳┪锏男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制細(xì)胞凋亡及促進腫瘤增殖,影響肺癌的發(fā)生。目前在歐洲人群及亞洲人群中均報道了該基因家族的遺傳變異與肺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān),但該關(guān)聯(lián)機制究竟是通過吸煙傾向來介導(dǎo),或是通過基因多態(tài)性對肺癌直接作用,或是兩者共同發(fā)揮作用,目前的研究結(jié)果尚不一致。前期研究主要是基于芯片技術(shù),根據(jù)遺傳區(qū)域間的連鎖不平衡(Linkage disequilibrium,LD)原理對相關(guān)區(qū)域進行標(biāo)簽定位(tagging SNP,tSNP)分析,選擇代表性SNPs進行分析和評價。該策略能高效快速篩選出疾病易感位點,后期通過獨立人群驗證和功能驗證找出真陽性遺傳位點,但會遺漏掉大量假陰性遺傳位點,對識別出的位點也很難鑒定其是否是致病位點(Causal SNP)。鑒于以上研究不足,有必要對15q25區(qū)域進行全面系統(tǒng)的研究,并在不同種族人群中驗證其多態(tài)性改變與肺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系,進一步探討遺傳因素和吸煙暴露對易感基因潛在功能的影響。目前快速發(fā)展的二代測序技術(shù)(NGS)可通過目標(biāo)區(qū)域靶向捕獲后進行高通量測序,對區(qū)域內(nèi)每一個位點進行精準(zhǔn)定位,可彌補前期基于芯片的技術(shù)盲區(qū)。本課題采用兩階段病例-對照研究設(shè)計:第一階段為篩選階段,研究對象為2003-2009年來自南京地區(qū)的200例經(jīng)病理學(xué)診斷的肺癌病例和300例經(jīng)年齡、性別匹配的同期在醫(yī)院進行常規(guī)體檢的非肺部疾病患者或者參加社區(qū)人群疾病篩查的健康個體作為對照;第二階段為驗證階段,分為中國人群內(nèi)部驗證和歐美人群外部驗證,其中前者由本課題組前期肺癌GWAS研究(2,331例病例/3,077例對照)構(gòu)成,后者由美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute,NCI)公布的多個歐美人群肺癌GWAS研究(5,716例病例/5,821例對照)構(gòu)成。初篩階段利用安捷倫SureSelect靶向序列捕獲系統(tǒng)對Chr15:78800300-78983700區(qū)域進行全覆蓋精細(xì)捕獲,并結(jié)合高通量二代測序平臺進行目標(biāo)區(qū)域測序,通過生物統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)多步驟分析和篩查,共檢測到1385個遺傳變異。為了保證研究結(jié)果的把握度,后續(xù)分析重點關(guān)注369個常見遺傳變異(MAF≥0.05)。具體生物統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)分析步驟包括:通過FASTQ、BWA、Picard Tools、GATK等一系列軟件對測序原始數(shù)據(jù)進行處理,得到點突變(SNP);在相加模型下采用Logistic回歸模型計算遺傳變異的關(guān)聯(lián)P值、比值比(odds ratio,OR)以及95%可信區(qū)間(confidence interval,CI);通過全基因組復(fù)雜特征分析(genome-wide complex trait analysis:GCTA)進行條件分析(Conditional analysis)鑒別獨立效應(yīng)位點;對篩選出的位點利用HaploReg v4.1、UCSC、RegulomeDB GTEx(Genotype-Tissue Expression)eQTL Browser等多個公共數(shù)據(jù)庫資源和預(yù)測軟件評價各位點的功能以及進行數(shù)量表達(dá)性狀分析;采用中介分析來探討遺傳位點、吸煙與肺癌三者之間的關(guān)系。初篩階段捕獲測序大小為183kb,捕獲區(qū)域的覆蓋度達(dá)到76%,測序平均深度為99×,并且發(fā)現(xiàn)了一系列與肺癌發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)的位點(P0.05)。經(jīng)過逐步條件分析后,發(fā)現(xiàn)15q25區(qū)域存在兩個獨立效應(yīng)位點與中國人群肺癌易感性顯著相關(guān)(rs6495304:OR=1.79,P=9.37×104;rs7473352:OR=1.68,P=8.05×10-3)。內(nèi)部驗證結(jié)果證實在中國人群中rs6495304和rs74733525影響肺癌的發(fā)生(rs6495304:P=5.16×10-10;rs74733525:P=4.29×10-04);然而,外部驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)在歐美人群中其關(guān)聯(lián)效應(yīng)顯著性降低(rs6495304:P=6.27×10-3),證明不同種族個體間存在遺傳異質(zhì)性。此外,研究發(fā)現(xiàn)rs6495304僅在男性或吸煙人群中顯著影響肺癌的發(fā)病風(fēng)險,且與吸煙存在交互作用(P=0.004)。表達(dá)數(shù)量性狀位點分析(Expression quantitative trait loci,eQTLs)表明在81個健康個體的下丘腦部位rs6495304-A等位基因與CHRNA3低表達(dá)量顯著相關(guān)(P=0.029)。中介分析結(jié)果表明,吸煙行為在rs6495304對肺癌發(fā)病風(fēng)險的影響中起到部分中介作用。本課題利用目標(biāo)區(qū)域捕獲測序技術(shù)系統(tǒng)篩選了該區(qū)域常見遺傳變異,并進一步通過大樣本人群和兩階段病例對照研究設(shè)計發(fā)現(xiàn)了兩個新的獨立效應(yīng)位點與中國人群肺癌發(fā)病顯著相關(guān),進一步功能注釋和中介分析表明rs6495304可能通過影響乙酰膽堿受體基因的表達(dá)調(diào)控吸煙成癮相關(guān)通路進而影響肺癌的發(fā)生。本研究結(jié)果為中國人群肺癌的高危人群篩查、早期診斷和個體化治療提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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