本文關(guān)鍵詞：外源性HMGB1對(duì)放療后殘存胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡研究　出處：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究目的:本研究通過(guò)體外探討放療后胰腺癌細(xì)胞上清液中的高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的含量,并進(jìn)一步探討其對(duì)放療后殘存胰腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響及其確切機(jī)制,從而為胰腺癌的臨床精準(zhǔn)的診斷、完善的治療提供有效的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。研究方法:(1)光學(xué)顯微鏡拍攝經(jīng)過(guò)不同劑量放療后殘存人胰腺癌細(xì)胞株(SW1990、Patu8988、PANC-1、Aspc-1)的形態(tài)變化。(2)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)不同劑量放療后人胰腺癌細(xì)胞株(SW1990、Patu8988、PANC-1、Aspc-1)上清液中HMGB1的含量。(3)采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法評(píng)價(jià)不同濃度的HMGB1對(duì)放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖活性影響,篩選出最佳作用濃度。(4)采用CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察放療后上清液對(duì)放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖活性的影響。(5)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)放療后上清液對(duì)放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡外源性的影響。(6)Western-Blot檢測(cè)經(jīng)上清液干預(yù)后,放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl2/Bax及Caspase-3、Cleaved Caspase-3和增殖相關(guān)蛋白C-myc和Ki67表達(dá)的變化。(7)應(yīng)用熒光定量PCR和Western-Blot檢測(cè)4種人胰腺癌細(xì)胞株(SW1990、Patu8988、PANC-1、Aspc-1)中TLR2的m RNA、蛋白相對(duì)表達(dá)水平。(8)采用倒置熒光顯微鏡觀察sh-TLR2在胰腺癌SW1990中的轉(zhuǎn)染效率,熒光定量PCR和Western-Blot檢測(cè)sh-TLR2在胰腺癌SW1990細(xì)胞中的干擾效率。(9)Western-Blot檢測(cè)經(jīng)過(guò)HMGB1干預(yù)后,放療后殘存sh-TLR2 SW1990細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白以及增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。研究結(jié)果:(1)光學(xué)顯微鏡觀察到放療后人胰腺癌細(xì)胞株(SW1990、Patu8988、PANC-1、Aspc-1)隨著放療劑量的不同,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不同程度的變化。(2)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在10Gy放療劑量下,胰腺癌SW1990上清液中HMGB1濃度達(dá)到最大。(3)CCK-8結(jié)果顯示隨著外源性HMGB1的作用濃度梯度的增加,其對(duì)10Gy放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞增殖活性的促進(jìn)作用不同,并以HMGB1濃度為100 ng/m L時(shí)作用最明顯。(4)CCK-8結(jié)果顯示上液清+EP(Ethyl pyruvate,丙酮酸乙酯,HMGB1釋放抑制劑)組、上清液組、HMGB1(100ng/m L)組與PBS組比較,顯著促進(jìn)了10Gy放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞的增殖活性,并且HMGB1(100ng/m L)組較上清液組的促進(jìn)細(xì)胞增殖能力更加明顯。(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,上清液+EP組、上清液組、HMGB1(100ng/m L)組中早期和晚期凋亡細(xì)胞比例明顯低于PBS組,同時(shí)HMGB1(100ng/m L)組與上清液組比較,前者的早期和晚期凋亡的細(xì)胞比例明顯減少。(6)Western-Blot結(jié)果顯示,放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞經(jīng)上清液干預(yù)后,凋亡相關(guān)蛋白Bcl2/Bax及Caspase-3表達(dá)下調(diào),而Cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào),以及增殖相關(guān)蛋白C-myc和Ki67表達(dá)上調(diào)。(7)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,SW1990細(xì)胞中TLR2表達(dá)水平最高。(8)倒置熒光顯微鏡下結(jié)果顯示,sh-TLR2組和sh-EGFP組的SW1990細(xì)胞均具有高轉(zhuǎn)染效率。熒光定量PCR和Western-Blot檢測(cè)結(jié)果顯示sh-TLR2組的SW1990具有高干擾效率,并篩選得到穩(wěn)定的sh-TLR2 SW1990細(xì)胞株。(9)Western-Blot檢測(cè)經(jīng)過(guò)HMGB1干預(yù)后,在放療后殘存sh-TLR2 SW1990細(xì)胞中,隨著時(shí)間的增加,Wnt信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白GSK-3β表達(dá)上升,P-GSK-3β(ser9)表達(dá)下降,β-catenin表達(dá)上升,并且凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3隨著時(shí)間的增加而降低,反之Cleaved Caspase-3表達(dá)升高,增殖相關(guān)蛋白Ki67隨著時(shí)間的增加而降低。結(jié)論:(1)本研究證實(shí)在體外胰腺癌SW1990細(xì)胞放療后的上清液中存在HMGB1,與放療劑量不存在明顯的相關(guān)性。(2)本研究證實(shí)外源性HMGB1和上清液對(duì)放療后殘存胰腺癌SW1990細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和凋亡抵抗的作用。(3)本研究證實(shí)在胰腺癌SW1990中,HMGB1通過(guò)TLR2,調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)控放療后殘存胰腺癌的增殖和凋亡抵抗。為針對(duì)胰腺癌放療后存在的HMGB1相關(guān)作用的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1331192