本文關(guān)鍵詞：雌激素對(duì)去勢(shì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Periostin表達(dá)影響的研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是困擾絕經(jīng)后婦女的常見問題,主要由絕經(jīng)后雌激素分泌減少所致[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是頜骨骨質(zhì)丟失的常見危險(xiǎn)因素,可加速牙槽骨的吸收,進(jìn)而導(dǎo)致牙齦退縮,牙根暴露,牙齒松動(dòng)脫落等,這給正畸治療中牙齒的移動(dòng)及牙齒缺失后的義齒或種植修復(fù)等帶來了很多困難[2]。雌激素替代治療一直是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要治療方法,但骨組織并非雌激素的唯一靶器官,長(zhǎng)期服用雌激素可增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、卵巢癌、血栓栓塞、膽囊炎等的發(fā)生率[3,4]。如何更有效地促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的骨再生及牙周缺損的修復(fù),越來越受到醫(yī)療工作者的關(guān)注與重視。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)是一類具有自我更新及多向分化潛能的成體干細(xì)胞,利用BMMSCs移植治療骨質(zhì)疏松引起的牙周缺損一直是目前的研究熱點(diǎn)。但有研究表明,在雌激素缺乏的微環(huán)境中,BMMSCs的增殖、凋亡及成骨分化能力均受到一定的影響[5,6]。因此,從分子或基因水平尋找有效且可靠的方法來恢復(fù)BMMSCs的成骨分化能力可能是治療的關(guān)鍵。骨膜蛋白(Periostin)是由成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞所分泌的一種粘附蛋白,其可促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附、遷移、增殖及分化等,在調(diào)控骨發(fā)育及代謝中發(fā)揮了重要的作用[7-9]。然而對(duì)于雌激素是否通過影響Periostin在BMMSCs中的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)BMMSCs的生理功能,目前仍未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究分別從去勢(shì)(OVX)和假手術(shù)(SHAM)組SD大鼠骨髓中分離培養(yǎng)BMMSCs,比較兩組BMMSCs成骨分化能力及Periostin m RNA的表達(dá)水平,并在此基礎(chǔ)上探索17β-雌二醇(17β-E2)對(duì)去勢(shì)大鼠BMMSCs中Periostin m RNA表達(dá)水平的影響,從而為利用Periostin改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者BMMSCs的成骨分化能力提供一定的參考依據(jù)。研究?jī)?nèi)容:1、去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的構(gòu)建與鑒定通過對(duì)雌性SD大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)來構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型,對(duì)照組則僅去除卵巢周圍等量的脂肪組織而保留雙側(cè)卵巢。術(shù)后12周,分別取兩組大鼠股骨進(jìn)行HE染色及Micro-CT掃描以鑒定絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型構(gòu)建成功與否。2、rBMMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法從SD大鼠股骨與脛骨中分離培養(yǎng)r BMMSCs,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并用流式細(xì)胞儀對(duì)r BMMSCs細(xì)胞表面的特異性標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。3、檢測(cè)兩組r BMMSCs的增殖與成骨分化能力及Periostin mRNA的表達(dá)情況采用CCK-8法檢測(cè)兩組r BMMSCs的增殖能力,然后對(duì)r BMMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)染色,并提取細(xì)胞RNA進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)因子OCN、BSP及Runx2m RNA的表達(dá)水平,進(jìn)而比較兩組r BMMSCs的成骨分化能力,同時(shí)還檢測(cè)兩組r BMMSCs中Periostin m RNA表達(dá)水平的差異。4、檢測(cè)17β-E2對(duì)去勢(shì)大鼠BMMSCs成骨分化能力及Periostin mRNA表達(dá)水平的影響(1)體外實(shí)驗(yàn):利用CCK-8法檢測(cè)不同濃度17β-E2對(duì)OVX組r BMMSCs增殖能力的影響以確定其最適刺激濃度,再用該濃度的17β-E2刺激OVX組r BMMSCs,利用成骨誘導(dǎo)染色及Real-time PCR分別檢測(cè)r BMMSCs成骨分化能力及Periostin m RNA表達(dá)水平的變化。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):SD大鼠去勢(shì)手術(shù)后3周開始皮下注射17β-E2溶液(10ug/kg),每2日注射1次,連續(xù)注射9周。采用HE染色及Micro-CT掃描觀察大鼠股骨微結(jié)構(gòu)的改變,并分離培養(yǎng)r BMMSCs,利用成骨誘導(dǎo)染色及Real-time PCR分別檢測(cè)r BMMSCs的成骨分化能力及Periostin m RNA的表達(dá)水平。研究結(jié)果:1、HE染色及Micro-CT掃描結(jié)果均顯示OVX組大鼠股骨骨小梁數(shù)量明顯減少,骨松質(zhì)蜂窩結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞,骨小梁穿孔甚至斷裂。骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)分析結(jié)果顯示OVX組大鼠股骨的BV/TV、Tb.Th及Tb.N值均顯著降低,Tb.Sp值則明顯增加,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、體外分離培養(yǎng)的r BMMSCs鏡下觀察多為梭形或多角形,呈放射狀或旋渦樣密集排列,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD90在所培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)率分別為96.6%、94.2%,而造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45的表達(dá)率分別則為1.3%、2.0%。3、CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示OVX組r BMMSCs的增殖速率明顯低于SHAM組,成骨誘導(dǎo)染色結(jié)果顯示OVX組ALP染色及鈣沉積均明顯減弱,Periostin m RNA表達(dá)顯著降低,同時(shí)OCN、BSP及Runx2 m RNA的表達(dá)水平也顯著降低(P0.05)。4、(1)體外實(shí)驗(yàn):CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示1×10-7mol/L17β-E2刺激OVX組r BMMSCs后,其增殖速率明顯高于其它濃度刺激組(P0.05),用該濃度刺激OVX組r BMMSCs后,結(jié)果顯示其ALP染色及鈣沉積增強(qiáng),Periostin m RNA表達(dá)顯著升高,同時(shí)OCN、BSP及Runx2 m RNA表達(dá)水平也明顯升高(P0.05)。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):去勢(shì)大鼠皮下注射17β-E2后,HE染色及Micro-CT掃描結(jié)果均顯示大鼠骨松質(zhì)微結(jié)構(gòu)破壞程度明顯減輕,對(duì)離體培養(yǎng)的r BMMSCs進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示r BMMSCs的ALP染色及鈣沉積較OVX組明顯增強(qiáng),r BMMSCs中Periostin、OCN、BSP及Runx2 m RNA表達(dá)水平也明顯高于OVX組(P0.05)。研究結(jié)論:1、采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法可獲取數(shù)量多且純度較高的r BMMSCs。2、雌激素缺乏條件下,r BMMSCs的增殖及成骨分化能力減弱,Periostin m RNA的表達(dá)水平顯著降低。3、體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),17β-E2可顯著促進(jìn)r BMMSCs中Periostin的表達(dá),并可有效增強(qiáng)其成骨分化能力。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781

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